פרוטוקול מקיף זה מורה כיצד ליצור גנומים קרובים של חיידקי שתן מגוונים ומאפשר לקוראים ללא ניסיון קידוד ליישם בהצלחה צינורות הרכבה וניתוח גנום מבוססי מסוף. מכלולי גנום שלמים מאפשרים גילוי גנים התורמים להתיישבות ולוויגולציה בקרב חיידקים מתחילים ואורופתוגניים. גנומים קרובים מספקים תובנה על ארכיטקטורת הגנום ואלמנטים גנטיים ניידים.
ניתן ליישם את שיטת הרכבת הגנום ההיברידית על כל חיידק שניתן לבודד מאתרים אנטומיים אחרים או נישות סביבתיות כדי לספק תובנות דומות על תוכן הגנום והארכיטקטורה. בצע את הפרוטוקול ואת מדריך היצרן כדי להכין מאגר DNA כפול נטוש ולהמשיך לנקות על ידי הוספת 2.5 פעמים את הנפח של חרוזים paramagnetic למאגר ה- DNA, ולאחר מכן בעדינות מהבהב הצינור לערבב את התוכן. בקצרה לסובב את המדגם ב 2, 000 פעמים G ומניחים את המדגם על סיבוב במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן גלולה החרוזים על המגנט.
לאחר מכן, לשטוף את הכדור פעמיים עם 250 microliters של 70% אתנול מוכן טרי במים ללא נוקלאז מבלי להפריע לכדור. השאר את הצינור על המגנט במהלך הכביסה. שאפו אתנול לאחר כל שטיפה, ולאחר מכן ספין בקצרה את המדגם ב 2, 000 פעמים G לפני החזרתו למגנט.
פיפטה את שאריות אתנול ולאפשר את הכדור להתייבש במשך 30 שניות. לאחר הייבוש, resuspend הכדור ב 60 עד 70 microliters של מים ללא נוקלאז ודגרה המדגם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות, ולאחר מכן גלולה את המדגם על המגנט עד elute הוא ברור. מעבירים את האלגנטיות לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר.
לכמת את מאגר ה- DNA הדו-גדילי המרוכז באמצעות פלואורומטר, ולאחר מכן להכין aliquot של 700 ננוגרם של המדגם בנפח הסופי 65 microliter להמשיך לשלב קשירת המתאם ולשמור על שארית הבריכה בארבע מעלות צלזיוס לריצה שנייה לאחר סיום הריצה הראשונה. המשך עם קשירת מתאם בהתאם להוראות היצרן. כדי להמשיך ברצף, ערבבו את מאגרי הפרימים והיכו את תא הזרימה.
הכן את פתרון ספריית הדנ"א וטען את ה- dropwise לדוגמה על יציאת הטעינה. התחל את ריצת הרצף. פתח את תוכנת ההפעלה לרצף ולחץ על לחצן התחל ולאחר מכן הזן שם עבור הניסוי.
עבור אל תמשיך בבחירת ערכות כדי לבחור את ערכת ההכנה המתאימה לספריה ואת חבילת הרחבת הברקוד המשמשת ולאחר מכן לחץ על המשך להפעיל אפשרויות. אם אתה מתכנן להכין ספריה מספקת להפעלה שנייה, התאם את אורך הריצה מ- ברירת המחדל 72 שעות ל- 48 שעות ולחץ על המשך הפעלה בסיסית. בדוק את אפשרות קריאת הבסיס בקריאות בסיס מהירות של תצורה.
הגדר את הברקוד לזמין כך שהפלט FASTQ יקוצץ את רצפי הברקוד ויהפוך לכלול מולטיפלקס לספריות נפרדות המבוססות על ברקוד. לחץ על המשך פלט. לאחר מכן, בחר היכן לשמור נתוני ריצוף פלט.
צפה לכ- 30 עד 50 ג'יגה-בתים של נתונים אם רק שומרים את פלט FASTQ ויותר מ- 500 ג'יגה-בתים של נתונים אם שומרים את פלט FAST5. אם אתם מתכננים להמשיך בסינון ידני לאחר הרצף, בטל את הסימון באפשרות הסינון Qscore באורך קריאה ללא סינון. אחרת, השאר את האפשרות מסומנת.
עבור אל תמשיך להפעיל את הכרטיסיה התקנה כדי לסקור את כל ההגדרות. אם ההגדרות נכונות, לחץ על לחצן התחל. אחרת, לחץ על הגב כדי לבצע את כל ההתאמות הדרושות.
בספריה 'קריאה ארוכה', צור ספריות חדשות עבור כל ברקוד המשמש בהפעלה. העתק את כל קבצי fastq התואמים לכל ברקוד לתיקיה המתאימה. שלב את כל קבצי fastq עבור כל ברקוד מכל ריצה.
לאחר שילוב הקבצים, פתח את המסוף ונווט לספריות הברקוד בתוך ספריית הקריאות הארוכות באמצעות הפקודה cd. כדי לרתק את כל קבצי fastq לכל ברקוד לקובץ fastq יחיד, בצע את הפקודה ולחזור על ההליך עבור כל ברקוד. השתמש ב- NanoStat כדי להעריך את איכות הקריאה של הדוגמה על-ידי ביצוע הפקודה ולאחר מכן הקלט את התוצאות על-ידי העתקת הפלט לקובץ טקסט או Word לעיון עתידי.
לאחר שמירת התוצאות, השתמש ב- NanoFilt לסינון קריאות MinION, תוך מחיקת קריאות עם Q פחות משבע ואורך קטן מ- 200 על-ידי ביצוע הפקודה. בקובץ החתוך שנוצר, הפעל את NanoStat עם הפקודה. הקלט את התוצאות על-ידי העתקת הפלט לקובץ טקסט או Word והשווה לתוצאות הקודמות כדי להבטיח שהסינון הצליח.
חזור על השלבים עבור כל ברקוד המשמש בהפעלת הרצף. ליצירת הרכבה גנומית היברידית, ארגן את קבצי הקריאה הקצרים ואת קבצי הקריאה הארוכה לספריה אחת בשם trimmed_reads. אז הספריה מכילה fastq שנוצר בעבר.
קובץ gz לקריאות ארוכות חתוכות ושתי מהירות. קבצי gz כ- R1 ו- R2 לקריאות קצרות חתוכות. נווט אל trimmed_reads הספריה המאחסנת את קבצי הקריאה באמצעות הפקודה cd במסוף.
פעם אחת בספריה הנכונה, תסגור את שני קבצי הקריאה הקצרים לאחסון ב- fastq. תבנית gz על-ידי ביצוע הפקודה. חזור על השלב הן עבור R1 והן עבור R2. ודא שכל קבצי הקריאה נמצאים ב- fastq.
תבנית gz וודאה שכל הקבצים תואמים לאותה איזו איזו. התחל את ההרכבה ההיברידית באמצעות Unicycler על-ידי הפעלת הפקודה. לאחר השלמת הריצה, סקור את חד-המידה.
קובץ יומן רישום כדי להבטיח שאין שגיאות. הקלט את המספר, הגודל והמצב המלא או המלא של ההקשר שנוצר. אם הקשרים לא שלמים מזוהים ביומן הרישום של יוניציקלר, הפעל מחדש את Unicycler במצב מודגש על-ידי הוספת הדגל לפקודה.
פתחו את 'תחבושת' ולחצו על הקובץ, ולאחר מכן בחרו גרף עומס ובחרו את ההרכבה. קובץ gfa שנשמר קודם לכן unicycler_output_directory שנוצר על-ידי Unicycler. לאחר טעינת הקובץ, לחץ על לחצן גרף הציור בסרגל הכלים השמאלי והערך אם ההרכבה הושלמה על-ידי בחינת אופן החיבורים והארגון.
נווט בתוך המסוף לתיקיה המאחסנת את פלט יוניציקלר באמצעות הפקודה cd. לאחר מכן הפעל פרוטוקול quast על-ידי ביצוע הפקודה. סקור את הדוחות שנוצרו על-ידי quast בספריית הפלט quast_output_directory.
נווט בתוך המסוף לתיקיה המאחסנת את פלט Unicycler באמצעות הפקודה cd ולאחר מכן הפעל את prokka על-ידי ביצוע הפקודה. סקור את הביאורים על-ידי פתיחת טבלת tsv ועל-ידי העלאת קובץ ה- gff שנוצר לתוכנת ניתוח הרצף. דמיין וניתח את הביאורים בתוכנה.
בתמונות הג'ל המייצגות, מתוארים תוצאות מיצוי DNA גנומי או gDNA. מיצוי מוצלח והפרדה של gDNA שלם ניתן לראות. מיצוי לא מוצלח המציג זיהום gDNA ו- RNA מקוטעים מתוארים גם הם.
גרפי הרכבת הגנום של חיידקים נוצרו על ידי הרכבה היברידית של יוניציקלר דה נובו ודמיינו על ידי תחבושת. הגנום המלא של קלבסילה אוקסיטוקה KoPF10 הדגים כרומוזום סגור יחיד ואת הגנום המלא של קלבסילה דלקת ריאות KpPF25 כלל כרומוזום סגור וחמישה פלסמידים סגורים. הכרומוזום הלא שלם של דלקת ריאות KpPF46 של קלבסילה כלל שני קונטיגים מחוברים.
מפות ההרכבה שנוצרו על ידי Geneious Prime עבור הגנום המלא של Klebsiella oxytoca KoPF10 ו Klebsiella דלקת ריאות KpPF25 מראה גנים מובאים מסומן על ידי חצים צבעוניים לאורך עמוד השדרה plasmid. כדי להבטיח שטעינת תאי הזרימה תצליח, סנן קריאות ארוכות באמצעות ההגדרות המומלצות והבטח שכל הקבצים נמצאים ב- fastq. gz format.
הפעל את הפקודה הנכונה של יוניציקלר באמצעות קבצים השייכים לאותה דוגמה.
