هذا البروتوكول يسد فجوة فنية في قدرتنا على توليد صفائف تسلسل طويلة جدا. فهو يمكننا من دراسة تعقيد الجينوم الذي يحد منه النهج الحالية للقراءة القصيرة في علم الجينوم. هذا الأسلوب هو فريد من نوعه في الأداء، والمتانة، وبراعة، وإمكانية الاندماج مع التطبيقات الجديدة الواعدة.
وهو ينطبق على مواد مختلفة ويمكن تحويرها لأحجام فورية مختلفة. وقد بدأت هذه التقنية ثورة في المشهد السريري. وقد تغلب تشخيص فائدة في اضطرابات التوسع المتكررة العديد من أوجه القصور الحالية.
وقد استخدمت بعض سجلات زرع عالية الدقة HLA-الطباعة من أجل نتائج سريرية أفضل. وتوفر هذه الطرق معلومات بعيدة المدى لم يمكن الوصول إليها من قبل مثل التدرج والتباين الهيكلي المعقد. إلى جانب قراءات اللاجينية في اختبار واحد ، فإنه سيمكن الطب الدقيق.
إنه بروتوكول طويل مع العديد من التقنيات الجديدة ومن الصعب معرفة ما إذا كان يعمل حتى التسلسل النهائي. أوصي ممارسة التحميل على الخلايا القديمة تدفق قبل تشغيل العينات. وقال المتعاونون بعض التقنيات مربكة بالمقارنة مع نهج القراءة القصيرة.
على وجه التحديد، استخراج هو ألطف نظرا للوعي عالية الجودة، والحمض النووي الوزن الجزيئي عالية. لبدء استخراج الحمض النووي HMW، أولا إضافة 200 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى 10 ملليلتر من العازلة تحلل في أنبوب 50 ملليلتر. ثم، دوامة في أعلى سرعة لمدة ثلاث ثوان.
واحتضان الحل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، إضافة اثنين microliters من RNS-A إلى lysate. تدوير بلطف أنبوب 50 ملليلتر لخلط العينة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة، إضافة 10 ملليلتر من طبقة الفينول من الفينول- الكلوروفورم-ايساميل خليط الكحول إلى lysate. ووضع الأنبوب على دوار في 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق تحت غطاء محرك الدخان. بعد الطرد المركزي مع أنابيب هلام، صب بعناية supernatant في أنبوب جديد 50 ملليلتر.
ثم، إضافة 25 ملليلتر من الجليد الباردة 100٪ الإيثانول، وتدوير بلطف الأنبوب باليد، حتى يترسب الحمض النووي. ثني طرف 20 ميكرولتر لجعل هوك. باستخدام هوك، تأخذ بعناية من الحمض النووي HMW والسماح للسوائل إسقاط.
ثم، ضع الحمض النووي في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 40 ملليلتر من 70٪ إيثانول، وعكس بلطف الأنبوب ثلاث مرات لغسل الحمض النووي. لإعداد المكتبة الميكانيكية القائمة على القص ، استخدم أولاً حقنة خالية من الإبر 100 ملليلتر للتطلع إلى جميع الحمض النووي. ثم، وضع إبرة قياس 27 على حقنة وإخراج كل الحمض النووي في الطبق بلطف وببطء.
كرر 29 مرة. بعد ذلك، أضف 143 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي الذي أعيد تعليقه و143 ميكرولترات من خليط تفاعل إصلاح الحمض النووي إلى أنبوب. قم بالتمرير الأنبوبي ست مرات لخلطه بلطف، ثم ضع الأنبوب على ددورة عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
الطرد المركزي الأنبوب في 1000G لمدة ثانيتين في درجة حرارة الغرفة لتدور أسفل العينة، ومن ثم وضع الأنبوب على رف المغناطيسي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تجاهل المابير بينما الأنبوب لا يزال على الرف. أضف 400 ميكرولترات من الإيثانول الطازج 70٪.
انتظر 30 ثانية. ثم قم بإزالة الإيثانول. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 1000G لمدة ثانيتين في درجة حرارة الغرفة لتدور أسفل العينة.
ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وأزل أي الإيثانول المتبقي. الهواء الجافة بيليه لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف 103 ميكرولترات من عازل T-E.
ثم، نفض الغبار الأنبوب بلطف لضمان أن يتم تغطية الخرز في المخزن المؤقت ووضع الأنبوب على الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وأخيرا، ضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة 10 دقائق إلى بيليه الخرز. استخدام طرف تحمل P200 واسعة لنقل 100 ميكرولترات من eluate إلى أنبوب 0.2 ملليلتر، والمضي قدما في نهاية إصلاح dA- ذيل ردود الفعل الربط محول.
لإعداد المكتبة القائمة على تجزئة transposase، أولا جعل رد فعل اغاسنتيشن الحمض النووي عن طريق إضافة 22 ميكرولتر من الحمض النووي HMW، وميكر واحد من 10 ملليمولار تريس، درجة 8، مع 0.02٪تريتون X-100، و 1 ميكرولتر من مزيج تجزئة، إلى أنبوب 0.2 ملليلتر. بعد ذلك ، استخدم نصيحة P200 واسعة لخلط التفاعل ست مرات ، واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تليها 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. عقد في أربع درجات مئوية.
وأخيراً، استخدم نصيحة تحمل P200 واسعة لنقل رد فعل إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وإضافة بسرعة 1 ميكرولتر من مزيج محول سريع. استخدام تلميح P200 تتحمل واسعة لخلط رد فعل ست مرات. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، والمضي قدما في التسلسل.
لبدء التسلسل، أدخل أولاً خلية تدفق جديدة في إحدى قنوات جهاز Nanopore. ثم، على برنامج التحكم التسلسل المصاحب، تحقق من مربع الموقع من خلية التدفق. حدد نوع خلية التدفق الصحيح وانقر على سير عمل خلية تدفق الاختيار.
انقر على زر بدء اختبار لبدء تحليل تدفق خلية مراقبة الجودة. المقبل، مع ماصة P1000 تعيين إلى 100 ميكرولتر، سحب مرة أخرى أقل من 30 ميكرولترات من العازلة لإزالة فقاعات من خلية التدفق. إضافة 30 ميكرولترات من مزيج فتيلة لتغطية الجزء العلوي من ميناء فتيلة لتجنب إدخال فقاعات.
ثم، ماصة 800 ميكرولترات من مزيج فتيلة في ميناء فتيلة لتحميل خلية تدفق. إخراج تلميح عندما يكون هناك حوالي 50 ميكرولتررس من المزيج فتيلة اليسار، وإضافة بقية مزيج فتيلة على الجزء العلوي من ميناء فتيلة. المقبل، مع ماصة P1000، إضافة 200 ميكرولترات من مزيج فتيلة في خلية تدفق.
ثم، قبل التحميل فقط، استخدم ماصة P200 تعيين إلى 80 ميكرولتررس إلى ماص صعودا وهبوطا مكتبة الحمض النووي ست مرات. وأخيراً، قم بتحميل المزيج إسقاط مكتبة من الحكمة في خلية تدفق من خلال منفذ العينة، ثم انتقل إلى التسلسل وتحليل البيانات. وأدى تحليل مراقبة الجودة للحمض النووي الجاهز لبناء مكتبة تعتمد على القص الميكانيكية إلى نسبة نقاء 260 إلى 280 حوالي 1.9، ونسبة 260 إلى 230 حوالي 2.3، مما يدل على عينة جيدة من الحمض النووي.
وشوهدت النتيجة نفسها باستخدام بناء المكتبة المستندة إلى تجزئة الحمض النووي الجاهزة للاندباس. حجم مراقبة الجودة من الحمض النووي HMW قلص إبرة بواسطة نبض هلام الكهربائي أظهرت أن غالبية الحمض النووي HMW كان أكبر من 50 كيلوباسس. وأظهرت نتائج أربعة أشواط باستخدام الخلية HG00733 أن N50 من مكتبة الميكانيكية المستندة إلى القص كان أقصر من مكتبة تجزئة transposase المستندة إلى.
أيضا, كان كلّ أربعة أشواط على 2300 يقرأ مع طول طويلة من 100 كيلوباس. وكان الطول الأقصى أطول في المكتبات القائمة على تجزئة الـ transposase مع وقت إعداد أقصر، مقارنة بالمكتبات الميكانيكية المستندة إلى القص. أنتجت المكتبات الميكانيكية المستندة إلى القص عدد القراءات الإجمالية أكثر مقارنة بالمكتبات القائمة على تجزئة الـ transposase، مما يشير إلى عائد أعلى.
وأظهرت المكتبات جودة عالية متسقة وأكثر من 97٪ من قواعدها الإجمالية كانت تتماشى مع الجينوم المرجعي البشري. وأظهرت التوزيعات المتوقعة للحجم أن جميع الأشواط الأربعة كانت لها نسبة كبيرة من البيانات التي تزيد عن 50 كيلوباسيس، في حين أن المكتبات القائمة على تجزئة نظام نقل الانبعاثات كانت نسبة أعلى من القراءات الطويلة جداً. الهدف العام هو الحفاظ على الحمض النووي سليم، لذلك من المهم تجنب أي تعامل قاس مع الحمض النووي.
عامل رئيسي يمكن أن يزيد قيمة الأسلوب هو التحليل الحسابي. طور فريقنا خط أنابيب تحليل طويل القراءة يسمى PICKY يمكنه اكتشاف مجموعة كاملة من SVs ذات حساسية عالية. وسوف تفتح آفاقا جديدة للمناطق المثيرة مثل الكشف عن المركبات الكهربائية المعقدة وإعادة ترتيب المراحل والتعديلات على مستوى جزيء واحد.
وهذا من شأنه أن يحسن كثيرا فهمنا لهندسة الجينوم. الفينول هو تآكل جدا. يجب عليك العمل معها في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، نظارات السلامة، معطف مختبر، السراويل الطويلة والأحذية.
