هذا البروتوكول تحسين التعقيم السطحي البذور، خطوة أساسية في الجينوم وظيفية من الأنواع النموذجية Arabidopsisthaliana. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي سهولة والإنتاجية العالية ، مما يسمح بمعالجة مئات العينات يوميا. مع بعض التعديلات البسيطة، يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنواع النباتية الأخرى النموذجية وغير النموذجية.
للمستخدمين لأول مرة، يرجى الانتباه إلى درجة حرارة المتوسط وسرعة الطرد المركزي لأنها على حد سواء حاسمة لبقاء البذور. للبدء، وإعداد الإيثانول 70٪عن طريق إضافة الإيثانول التقنية 95٪إلى الماء المقطر والاختلاط جيدا. بعد ذلك، قم بإعداد محلول التبييض بنسبة 5٪ عن طريق إضافة خمسة ملليلترات من التبييض المنزلي إلى 95 ملليلتر من الماء المقطر المعقم.
ثم، إضافة بضع قطرات من المنظفات غير المؤينة إلى محلول التبييض، وتخلط جيدا. بعد ذلك، قم بإعداد متوسط Murashige وSkoog بنصف القوة بإضافة 2.2 جرام من مسحوق MS المتوسط بما في ذلك الفيتامينات و10 غرامات من السكروز في 800 ملليلتر من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة للوسط إلى 5.7 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم الضرس واحد، ثم جعل حجم يصل إلى لتر واحد باستخدام الماء المقطر.
Aliquot 500 ملليلتر من المتوسط في زجاجة لتر واحد، وإضافة أربعة غرامات من أجار لإعداد وسيطة صلبة. بعد الالاستعباد التلقائي، اسمح للوسط أن يبرد إلى 50 إلى 53 درجة مئوية في حمام مائي. ثم صب في أطباق بيتري تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
لإعداد المتوسطة الانتقائية، إضافة kanamycin إلى المتوسطة، وتصب في أطباق بيتري كما هو موضح في وقت سابق. لإعداد الطامح، قم بتوصيل مدخل مضخة الفراغ إلى طرف واحد من أنبوب البولي إيثيلين بحجم مناسب. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب بمنفذ الغطاء ثنائي الاتجاه لزجاجة التكتكين.
التفاف تقاطع الأنابيب بإحكام مع فيلم الختم لضمان اتصال محكم. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب البولي إيثيلين الثاني بمدخل الغطاء المسماري على زجاجة التفكيك. ثم قم بتوصيل الجانب الآخر من الأنبوب بمنفذ صمام حوض السمك المزود بأنبوب بولي إيثيلين رفيع.
إذا لزم الأمر، التفاف تقاطع مع فيلم الختم للقضاء على تسرب الهواء. بعد وضع علامة على دفعتين من أنابيب الطرد الدقيق 48 1.5 ملليلتر مع أرقام تدريجية، إضافة 100 إلى 200 بذور Arabidopsis إلى كل من أنابيب الطرد الدقيق 96 العقيمة، ما يقرب من 1-2 ملليمتر فوق الجزء السفلي من نهاية مخروطية من الأنبوب. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية معقمة 10 ملليلتر ، أضف حوالي ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 70٪ في كل أنبوب ، وإغلاق الأغطية بعناية.
يهز الأنابيب على تردد التذبذب من ثمانية هيرتز لمدة ثلاث دقائق في شاكر. ثم قم بإزالة المحولات من شاكر ونقلها إلى سلة من جهاز الطرد الدقيق benchtop للغزل أسفل البذور باستخدام وظيفة النبض. بعد نقل الأنابيب إلى رف، افتح جميع الأنابيب تحت غطاء تدفق صفح.
لا تلمس الجزء من الأغطية المناسب في الأنابيب لتجنب التلوث. ثم، تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح، تناسب العقيمة 200 ميكرولتر تلميح أصفر على مدخل صمام الحوض من الطامح محلية الصنع، والتبديل على المضخة. أدخل طرف فقط فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص السائل.
بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية معقمة 10 ملليلتر ، aliquot ملليلتر واحد من محلول التبييض بنسبة 5٪ في كل أنبوب. أغلق الأغطية قبل وضع الأنابيب مرة أخرى في محولات الهزاز، ثم هز الأنابيب كما هو موضح سابقا. بعد الغزل أسفل البذور باستخدام وظيفة نبض جهاز الطرد المركزي benchtop، تناسب جديد عقيمة 200 ميكرولتر تلميح أصفر على صمام الحوض، والتبديل على المضخة.
أدخل الطرف فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص محلول التبييض. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية معقمة 10 ملليلتر ، aliquot ملليلتر واحد من الماء المعقم في كل أنبوب. بعد تركيب جديد العقيمة 200 ميكرولتر تلميح أصفر على صمام الحوض, التبديل على المضخة.
أدخل طرف فقط فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص الماء. وأخيرا، aliquot 500 ميكرولتر من المياه المعقمة في كل أنبوب، وإغلاق جميع الأغطية في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. البذور جاهزة الآن للذروة.
إذا لزم الأمر، والحفاظ على أنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى بضع ساعات أو في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. باستخدام ماصة ملليلتر واحد، نقل البذور مع 300 إلى 400 ميكرولتر من الماء العقيم في طبق بيتري. بعد نقل 10 أنابيب، صب 1.5 إلى اثنين من ملليلتر من موراشيج نصف القوة الذائبة وسكوغ المتوسطة دون المضادات الحيوية في كل لوحة.
دوامة بسرعة لوحة لتوزيع البذور، والشريط لوحات على طرفي نقيض. لف الصفائح في رقائق بلاستيكية أو ألومنيوم، ووضعها في ثلاجة لمدة ثلاثة أيام في الظلام للحصول على إنبات موحد. لم تشر تحليلات الإنبات التي أجريت في الأيام الثانية، الثلاثة، الأربعة، والسابعة إلى وجود اختلافات كبيرة بين 10 إلى 40 دقيقة من وقت التعقيم مع 70٪ إيثانول.
ومع ذلك ، عندما تجاوز وقت التعقيم 40 دقيقة ، انخفضت معدلات الإنبات. وفي المقابل، انخفضت أيضا معدلات ظهور الكوتيليدون الأخضر. وبناء على الدراسة، تم اختيار ثلاث دقائق لمدة 70٪ الإيثانول وثلاث دقائق لتبييض 5٪، والحد الأدنى من الوقت لتعقيم البذور.
لإثبات أن البذور المستخدمة في الأصل كانت ملوثة بالكائنات الحية الدقيقة ، تم زرع بذور غير معقمة مباشرة على الأطباق. بالمقارنة مع البذور المعقمة ، أظهرت البذور غير المعقمة مظهرا فطريا بعد يومين ، والذي انتشر في جميع أنحاء الصفائح بعد إنبات لمدة سبعة أيام. وأظهر فحص عبر التلوث أجريت باستخدام طرف واحد ماصة معقمة لمعالجة عينات البذور المختلفة أنه لم يلاحظ أي كوتيليدونس الخضراء في بذور النمط الجيني كولومبيا-0 زرعت في لوحات مع kanamycin.
في موازاة ذلك، في بذور كولومبيا-0 زرعت في لوحات دون kanamycin، ظهرت جميع cotyledons الخضراء بعد الإنبات. تشير هذه النتائج إلى عدم ترحيل التلوث بين العينات على الرغم من استخدام طرف ماصة واحد لإزالة المحلول العقيم. هذا الإجراء هو الأساس للعديد من أساليب الجينوم الوظيفية الأخرى مثل التعبير المفرط عن الجينات ، وتحرير الجينوم ، وتوطين دون الخلوي ، ونشاط المروج ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين والحمض النووي.
