Este protocolo melhora a esterilização da superfície das sementes, um passo fundamental na genômica funcional da espécie modelo Arabidopsisthaliana. As principais vantagens dessa técnica são facilidade e alto rendimento, permitindo o processamento de centenas de amostras por dia. Com algumas modificações simples, este método pode ser aplicado a muitas outras espécies de plantas modelo e não-modelo.
Para usuários iniciantes, preste atenção à temperatura do meio e à velocidade de centrifugação, pois ambos são críticos para a sobrevivência das sementes. Para começar, prepare 70% de etanol adicionando 95% de etanol técnico à água destilada e misturando bem. Em seguida, prepare a solução de 5% de alvejante adicionando cinco mililitros de alvejante doméstico a 95 mililitros de água destilada estéril.
Em seguida, adicione algumas gotas de detergente noniônico à solução de alvejante e misture bem. Em seguida, prepare o meio Murashige e Skoog de meia resistência adicionando 2,2 gramas de pó médio ms, incluindo vitaminas e 10 gramas de sacarose em 800 mililitros de água destilada. Ajuste o pH do médio para 5,7 usando um hidróxido de potássio molar e leve o volume até um litro usando água destilada.
Alíquota de 500 mililitros do meio em uma garrafa de um litro, e adicione quatro gramas de ágar para preparar um meio sólido. Após a autoclavagem, deixe o meio esfriar até 50 a 53 graus Celsius em um banho de água. Em seguida, despeje-o em pratos petri sob o capô de fluxo laminar.
Para preparar o meio seletivo, adicione kanamicina ao meio e despeje-a em pratos de Petri, como demonstrado anteriormente. Para configurar o aspirador, conecte a entrada da bomba de vácuo a uma extremidade de um tubo de polietileno de tamanho adequado. Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo à saída da tampa bidirenal da garrafa de decantação.
Enrole firmemente a junção do tubo com uma película de vedação para garantir a conexão hermética. Em seguida, conecte um segundo tubo de polietileno à entrada da tampa do parafuso na garrafa de decantação. Em seguida, conecte o outro lado do tubo à saída de uma válvula de aquário equipada com um fino tubo de polietileno.
Se necessário, enrole a junção com o filme de vedação para eliminar o vazamento de ar. Depois de rotular dois lotes de tubos de microcentrífa de 1,5 mililitro com números progressivos, adicione 100 a 200 sementes arabidopsis a cada um dos 96 tubos de microcentrifuus estéreis, aproximadamente um a dois milímetros acima da parte inferior da extremidade cônica do tubo. Em seguida, usando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros, adicione cerca de um mililitro de 70% de etanol em cada tubo e feche cuidadosamente as tampas.
Agite os tubos em uma frequência de oscilação de oito hertz por três minutos em um shaker. Em seguida, remova os adaptadores do agitador e transfira-os para a cesta de um microcentrifuuge benchtop para girar as sementes usando a função de pulso. Depois de transferir os tubos para um rack, abra todos os tubos sob o capô de fluxo laminar.
Não toque na parte das tampas que se encaixam nos tubos para evitar contaminação. Em seguida, sob a capa de fluxo laminar, coloque uma ponta amarela de 200 microliteres estérei na entrada da válvula de aquário do aspirador caseiro, e ligue a bomba. Insira a ponta logo acima do nível das sementes para evitar tocar nas sementes ao sugar o líquido.
Em seguida, usando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros, aliquot um mililitro de solução de alvejante de 5% em cada tubo. Feche as tampas antes de colocar os tubos de volta nos adaptadores do agitador e, em seguida, agite os tubos como demonstrado anteriormente. Depois de girar as sementes usando a função de pulso de uma centrífuga no topo do banco, coloque uma nova ponta amarela de 200 microliter estéril na válvula do aquário e ligue a bomba.
Insira a ponta acima do nível das sementes para evitar tocar nas sementes ao sugar a solução de alvejante. Em seguida, usando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros, aliquot um mililitro de água esterilizada em cada tubo. Depois de encaixar uma nova ponta amarela de 200 microliter estéril na válvula do aquário, ligue a bomba.
Insira a ponta logo acima do nível das sementes para evitar tocar nas sementes ao sugar a água. Finalmente, alíquota de 500 microliters de água esterilizada em cada tubo, e feche todas as tampas na capa de fluxo laminar. As sementes estão prontas para serem semeadas.
Se necessário, mantenha os tubos em temperatura ambiente por até algumas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira as sementes com 300 a 400 microliters de água estéril em uma placa de Petri. Depois de transferir 10 tubos, despeje 1,5 a dois mililitros de murashige de meia-força derretido e meio Skoog sem antibióticos em cada placa.
Gire rapidamente a placa para distribuir as sementes e tape as placas em lados opostos. Enrole as placas em papel alumínio ou papel alumínio e coloque-as em uma geladeira por três dias no escuro para obter germinação uniforme. As análises de germinação realizadas nos dias dois, três, quatro e sete não indicaram diferenças significativas entre 10 a 40 minutos de tempo de esterilização com 70% de etanol.
No entanto, quando o tempo de esterilização excedeu 40 minutos, as taxas de germinação diminuíram. Correspondentemente, as taxas de emergência de cotyledon verde também diminuíram. Com base no estudo, foram selecionados três minutos para 70% de etanol e três minutos para alvejante de 5%, como o tempo mínimo para esterilizar as sementes.
Para demonstrar que as sementes utilizadas originalmente estavam contaminadas com microrganismos, as sementes não estéreis foram semeadas diretamente nas placas. Em comparação com as sementes estéreis, as sementes não estéreis apresentaram uma aparência fúngica após dois dias, que se espalharam por todas as placas após uma germinação de sete dias. Um ensaio de contaminação cruzada realizado usando uma única ponta de pipeta estéril para processar diferentes amostras de sementes mostrou que não foram observados cotilledons verdes nas sementes genótipos columbia-0 semeadas em placas com kanamicina.
Em paralelo, na Columbia-0 sementes semeadas em placas sem kanamicina, todos os cotilledons apareceram verdes após a germinação. Estes resultados indicam que não há transferência de contaminação entre as amostras, apesar de usar uma única ponta de pipeta para remover a solução estéril. Este procedimento é a base para muitos outros métodos de genômica funcional, como superexpressão genética, edição de genomas, localização subcelular, atividade do promotor e interações proteína-proteína e proteína-DNA.
