Этот протокол улучшает стерилизацию поверхности семян, что является фундаментальным шагом в функциональной геномике модельного вида Arabidopsisthaliana. Основными преимуществами данной методики являются легкость и высокая пропускная способность, позволяющая обрабатывать сотни образцов в сутки. С некоторыми простыми модификациями этот метод может быть применен ко многим другим модельным и немодельным видам растений.
Для начинающих пользователей, пожалуйста, обратите внимание на температуру среды и скорость центрифугирования, поскольку они оба имеют решающее значение для выживания семян. Для начала приготовьте 70% этанола, добавив 95% технического этанола в дистиллированную воду и тщательно перемешав. Далее готовят 5% раствор отбеливателя, добавляя пять миллилитров бытового отбеливателя к 95 миллилитрам стерильной дистиллированной воды.
Затем добавьте несколько капель неионного моющего средства в раствор отбеливателя и тщательно перемешайте. Затем приготовьте половинную крепость Murashige и Skoog medium, добавив 2,2 грамма порошка MS medium, включая витамины и 10 граммов сахарозы в 800 миллилитрах дистиллированной воды. Отрегулируйте рН среды до 5,7 с помощью одного молярного гидроксида калия, затем доведите объем до одного литра с помощью дистиллированной воды.
Aliquot 500 миллилитров среды в литровую бутылку, и добавить четыре грамма агара для приготовления твердой среды. После автоклавирования дайте среде остыть до 50-53 градусов цельсия на водяной бане. Затем налейте его в чашку Петри под ламинарным вытяжкой.
Чтобы приготовить селективную среду, добавьте к среде канамицин и вылейте его в чашку Петри, как показано ранее. Для настройки аспиратора подключите входное отверстие вакуумного насоса к одному концу полиэтиленовой трубки подходящего размера. Затем подключите другой конец трубки к выходу двусторонней крышки декантационного флакона.
Плотно оберните соединение трубки уплотнительной пленкой, чтобы обеспечить герметичное соединение. Затем подключите вторую полиэтиленовую трубку к входному отверстию винтовой крышки на декантационном флаконе. Затем подключите другую сторону трубки к выходному отверстию аквариумного клапана, оснащенного тонкой полиэтиленовой трубкой.
При необходимости оберните соединение уплотнительной пленкой для устранения утечки воздуха. После маркировки двух партий из 48 1,5-миллилитровых микроцентрифужных трубок с прогрессивными числами добавьте от 100 до 200 семян арабидопсиса к каждой из 96 стерильных микроцентрифужных трубок, примерно на один-два миллиметра выше нижней части конического конца трубки. Затем, используя 10-миллилитровую стерильную серологическую пипетку, добавьте около одного миллилитра 70% этанола в каждую трубку и осторожно закройте крышки.
Встряхните трубки с частотой колебаний восемь герц в течение трех минут в шейкере. Затем извлеките адаптеры из шейкера и переложите их в корзину настольной микроцентрифуги для отжима семян с помощью функции импульса. После переноса трубок в стойку откройте все трубки под ламинарным проточным капотом.
Не прикасайтесь к части крышек, врезающихся в трубки, чтобы избежать загрязнения. Затем под ламинарной вытяжкой поместите стерильный 200-микролитровой желтый наконечник на входное отверстие аквариумного клапана самодельного аспиратора и включите насос. Вставьте наконечник чуть выше уровня семян, чтобы избежать прикосновения к семенам при высасывании жидкости.
Далее, используя 10-миллилитровую стерильную серологическую пипетку, аликвот по одному миллилитру 5%-ного отбеливающего раствора в каждую пробирку. Закройте крышки, прежде чем поместить трубки обратно в адаптеры шейкера, затем встряхните трубки, как было показано ранее. После раскрутки семян с помощью импульсной функции настольной центрифуги установите новый стерильный 200-микролитровый желтый наконечник на клапан аквариума и включите насос.
Вставьте наконечник выше уровня семян, чтобы не касаться семян при высасывании раствора отбеливателя. Далее, используя 10-миллилитровую стерильную серологическую пипетку, аликвотировать по одному миллилитру стерилизованной воды в каждую трубку. После установки нового стерильного 200-микролитрового желтого наконечника на клапан аквариума включите насос.
Вставьте наконечник чуть выше уровня семян, чтобы избежать прикосновения к семенам при всасывании воды. Наконец, аликвотьте 500 микролитров стерилизованной воды в каждую трубку и закройте все крышки в ламинарной вытяжке. Семена уже готовы к посеву.
При необходимости держите трубки при комнатной температуре до нескольких часов или при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Используя одномиллилитровую пипетку, переложите семена с 300-400 микролитрами стерильной воды в чашку Петри. После переноса 10 пробирок влейте в каждую пластину от 1,5 до двух миллилитров расплавленной среды мурашиге и скуга без антибиотиков.
Быстро закрутите тарелку, чтобы распределить семена, и заклейте тарелки на противоположные стороны. Оберните пластины в пластиковую или алюминиевую фольгу, и поместите их в холодильник на три дня в темноте для получения равномерного прорастания. Анализы прорастания, выполненные во второй, третий, четвертый и седьмой дни, не показали существенных различий между 10-40 минутами времени стерилизации с 70% этанолом.
Однако, когда время стерилизации превышало 40 минут, скорость прорастания снижалась. Соответственно, снизились и показатели появления зеленого семядолона. Основываясь на исследовании, три минуты для 70% этанола и три минуты для 5% отбеливателя были выбраны в качестве минимального времени для стерилизации семян.
Чтобы продемонстрировать, что первоначально используемые семена были загрязнены микроорганизмами, нестерильные семена высеяли непосредственно на пластины. По сравнению со стерильными семенами, нестерильные семена показали грибковый вид через два дня, который распространился по всем тарелкам после семидневного прорастания. Анализ перекрестного загрязнения, проведенный с использованием одного стерильного наконечника пипетки для обработки различных образцов семян, показал, что в семенах генотипа Columbia-0, посеянных в пластины с канамицином, не наблюдалось зеленых семядолий.
Параллельно в семенах Columbia-0, посеянных в тарелки без канамицина, все семядоли после прорастания оказались зелеными. Эти результаты указывают на отсутствие переноса загрязнения между образцами, несмотря на использование одного наконечника пипетки для удаления стерильного раствора. Эта процедура является основой для многих других методов функциональной геномики, таких как сверхэкспрессия генов, редактирование генома, субклеточная локализация, промоторная активность и белково-белковые и белково-ДНК-взаимодействия.
