פרוטוקול זה לשפר את עיקור פני השטח זרעים, צעד בסיסי בגנומיקה פונקציונלית של מינים המודל Arabidopsisthaliana. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם קלות ותפוקה גבוהה, המאפשר עיבוד של מאות דגימות ליום. עם כמה שינויים פשוטים, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מינים רבים אחרים מודל ולא מודל צמחים.
עבור משתמשים בפעם הראשונה, אנא שימו לב לטמפרטורת המדיום ומהירות המרכז מכיוון ששניהם קריטיים להישרדות הזרעים. כדי להתחיל, להכין 70% אתנול על ידי הוספת 95% אתנול טכני למים מזוקקים וערבוב ביסודיות. לאחר מכן, להכין פתרון אקונומיקה 5% על ידי הוספת חמישה מיליליטר של אקונומיקה ביתית ל 95 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים.
לאחר מכן, מוסיפים כמה טיפות של חומר ניקוי לא-יוני לתמיסת אקונומיקה, ומערבבים היטב. לאחר מכן, להכין חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני על ידי הוספת 2.2 גרם של אבקה בינונית MS כולל ויטמינים ו 10 גרם של סוכרוז ב 800 מיליליטר של מים מזוקקים. התאימו את רמת ה-pH של המדיום ל-5.7 בעזרת אשלגן הידרוקסיד טוחן אחד, ואז העלו את הנפח לליטר אחד באמצעות מים מזוקקים.
Aliquot 500 מיליליטר של המדיום לתוך בקבוק ליטר אחד, ולהוסיף ארבעה גרם של אגר כדי להכין מדיום מוצק. לאחר autoclaving, לאפשר למדיום להתקרר עד 50 עד 53 מעלות צלזיוס באמבט מים. ואז לשפוך אותו לתוך צלחות פטרי מתחת מכסה המנוע זרימה למינאר.
כדי להכין מדיום סלקטיבי, מוסיפים kanamycin למדיום, ויוצקים אותו לתוך מנות פטרי כפי שהוכח קודם לכן. כדי להגדיר את השאיפה, חבר את זרם משאבת ואקום לקצה אחד של צינור פוליאתילן בגודל מתאים. לאחר מכן חבר את הקצה השני של הצינור לשקע של המכסה הדו-כיווני של בקבוק decantation.
עוטפים את צומת הצינורות בחוזקה עם סרט איטום כדי להבטיח חיבור אטום. לאחר מכן, חבר צינור פוליאתילן שני לפרצון מכסה הבורג על בקבוק decantation. ואז לחבר את הצד השני של הצינור לשקע של שסתום אקווריום מצויד צינור פוליאתילן דק.
במידת הצורך, לעטוף את הצומת עם סרט האיטום כדי לחסל דליפת אוויר. לאחר תיוג שתי קבוצות של 48 צינורות microcentrifuge 48 1.5 מיליליטר עם מספרים מתקדמים, להוסיף 100 עד 200 זרעי Arabidopsis לכל אחד 96 צינורות microcentrifuge סטרילי, בערך אחד עד שני מילימטרים מעל החלק התחתון של הקצה החרוט של הצינור. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר, להוסיף סביב מיליליטר אחד של 70% אתנול לתוך כל צינור, בזהירות לסגור את המכסים.
לנער את הצינורות בתדר תנודה של שמונה הרץ במשך שלוש דקות בשייקר. לאחר מכן להסיר את המתאמים מן שייקר ולהעביר אותם לתוך הסל של microcentrifuge ספסל עבור ספינינג את הזרעים באמצעות פונקציית הדופק. לאחר העברת הצינורות למדף, פתח את כל הצינורות מתחת למכסה המנוע.
אין לגעת בחלק של המכסים המתאימים לצינורות כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע של זרימת למינאר, התאימו קצה צהוב סטרילי של 200 מיקרוליטר למפרצון שסתום האקווריום של השאיפה תוצרת בית, והדליקו את המשאבה. הכנס את הקצה ממש מעל רמת הזרעים כדי למנוע נגיעה בזרעים בעת מציצת הנוזל.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר, aliquot אחד מיליליטר של 5% פתרון אקונומיקה לתוך כל צינור. סגור את המכסים לפני הנחת הצינורות בחזרה לתוך מתאמי שייקר, ולאחר מכן לנער את הצינורות כפי שהוכח בעבר. לאחר ספינינג את הזרעים באמצעות פונקציית הדופק של צנטריפוגה benchtop, להתאים קצה צהוב סטרילי חדש 200 מיקרוליטר על שסתום האקווריום, ולהדליק את המשאבה.
הכנס את הקצה מעל רמת הזרעים כדי למנוע נגיעה בזרעים בעת מציצת תמיסה אקונומיקה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר, aliquot אחד מיליליטר של מים מעוקרים לתוך כל צינור. לאחר התאמת קצה צהוב סטרילי חדש 200 מיקרוליטר על שסתום האקווריום, להפעיל את המשאבה.
הכנס את הקצה ממש מעל רמת הזרעים כדי למנוע נגיעה בזרעים בעת מציצת המים. לבסוף, aliquot 500 microliters של מים מעוקרים לתוך כל צינור, ולסגור את כל המכסים במכסה המנוע זרימה למינאר. הזרעים מוכנים כעת לזרע.
במידת הצורך, לשמור על הצינורות בטמפרטורת החדר עד כמה שעות או בארבע מעלות צלזיוס לילה. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, להעביר את הזרעים עם 300 עד 400 microliters של מים סטריליים לתוך צלחת פטרי. לאחר העברת 10 צינורות, לשפוך 1.5 עד שני מיליליטר של מומס חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני ללא אנטיביוטיקה לתוך כל צלחת.
מערבבים במהירות את הצלחת כדי להפיץ את הזרעים, ומדביקים את הצלחות משני הצדדים. עוטפים את הצלחות בנייר פלסטיק או אלומיניום, ומניחים אותן במקרר במשך שלושה ימים בחושך כדי לקבל נביטה אחידה. ניתוחי נביטה שבוצעו בימים שניים, שלושה, ארבעה ושבע הצביעו על הבדלים משמעותיים בין 10 ל -40 דקות של זמן עיקור עם 70%אתנול.
עם זאת, כאשר זמן העיקור עלה על 40 דקות, שיעורי הנביטה ירדו. בהתאמה, שיעורי הופעת קוטילדון ירוק גם ירד. בהתבסס על המחקר, שלוש דקות עבור 70%אתנול ושלוש דקות עבור 5%אקונומיקה נבחרו כזמן המינימלי לחיטוי הזרעים.
כדי להדגים כי הזרעים ששימשו במקור היו מזוהמים עם מיקרואורגניזמים, זרעים לא סטריליים נזרעו ישירות על הצלחות. בהשוואה לזרעים סטריליים, זרעים לא סטריליים הראו מראה פטרייתי לאחר יומיים, אשר התפשטו על כל הצלחות לאחר נביטה של שבעה ימים. בדיקת זיהום צולבת שבוצעה באמצעות טיפ פיפטה סטרילי יחיד לעיבוד דגימות זרעים שונות הראתה כי לא נצפו קוטילדון ירוק בזרעי הגנוטיפ של קולומביה-0 שנזרעו בצלחות עם קנאמיצין.
במקביל, בקולומביה-0 זרעים נזרעו בצלחות ללא קנאמיצין, כל הקוטילדון הופיע ירוק לאחר הנביטה. תוצאות אלה מצביעות על כך שאין נשיאה של זיהום בין דגימות למרות שימוש בקצה פיפטה יחיד כדי להסיר את הפתרון הסטרילי. הליך זה הוא הבסיס לשיטות גנומיקה פונקציונליות רבות אחרות כגון ביטוי יתר של גנים, עריכת גנום, לוקליזציה תת-תאית, פעילות מקדם, ואינטראקציות חלבון-חלבון-DNA.
