هذا البروتوكول هو وسيلة بسيطة جدا وفعالة للكشف عن المسوخ التي ولدتها التكنولوجيا CRISPR / Cas9 من العديد من الأفراد. والميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية هما أنه يمكن القيام بذلك في غضون ساعات قليلة وأنه ينطبق على العديد من الكائنات الحية. تصميم التمهيدي يمكن أن يكون تحديا لبعض الجينات وجولات متعددة من تصميم التمهيدي والتحقق قد تكون هناك حاجة لجعل HRMA كفاءة.
لتنفيذ PCR متدرجة، ابدأ بإعداد مزيج رئيسي. ثم قم بإزالة 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتحكم غير القالب أو NTC في لوحة 96 جيدا. ثم قم بإضافة القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقي.
Aliquot 20 ميكرولتر من مزيج العينة في لوحة 96 جيدا. نفذ PCR باتباع معلمات ركوب الدراجات ثم قم بتوليد ملفات تعريف الذوبان الحراري باستخدام المعلمات المذكورة في المخطوطة. بعد جمع جميع المواد المطلوبة، وإعداد مزيج رئيسي مع 0.5 ميكرولتر من كاشف إطلاق الحمض النووي و 20 ميكرولتر من العازلة تخفيف لكل فرد لتكون النمط الجيني.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، aliquot 20 ميكرولتر من هذا المزيج في لوحة PCR وترك لوحة PCR على الجليد. بعد ذلك ، ضع بعوض G1 المخدر في طبق بيتري زجاجي لإبقائه مخدرا ووضع ثمانية بعوض من النوع البري في طبق بيتري الثاني. مسح زوج من الملاقط مع 70٪ الإيثانول واستخدام ملاقط تطهيرها لإزالة واحدة من البعوض الساقين الخلفيتين.
ثم غمر الساق في محلول كاشف إطلاق الحمض النووي. ضع البعوضة في القارورة المقابلة واغلق القارورة بإسفنجة. بمجرد الانتهاء ، امسح الملاقط بإيثانول بنسبة 70٪ قبل الشروع في إزالة الساق من البعوضة التالية حتى يتم الانتهاء من لوحة 96 بئرا.
في وقت لاحق، ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية واحتضان لوحة PCR التي تحتوي على الساقين في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، تليها الحضانة في 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين. السماح للطبق لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لPCR، وإعداد مزيج رئيسي يحتوي على المكونات المفضلة ومن ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96 جيدا.
بعد نقل ميكرولتر واحد من محلول إطلاق الحمض النووي الذي يحتوي على الحمض النووي للبعوض الذي تم إعداده مسبقا إلى اللوحة ، ختم اللوحة بختم لوحة PCR بصري. قم بإجراء PCR باستخدام معلمات ركوب الدراجات المناسبة لإنشاء ملفات تعريف ذوبان حراري باتباع المعلمات الموضحة في المخطوطة ، ثم قم بفحص ملفات تعريف الذوبان عن طريق تعيين التحكم البري إلى الكتلة المرجعية. وضع علامة على المجموعات المختلفة ذات الألوان المطابقة على قالب 96-well.
بعد ذلك، حدد الأفراد مع منحنيات الاهتمام وإزالة الأفراد المحددين من أنابيب إلى الصليب مرة أخرى. الدم تغذية جعلت من الإناث، تليها جمع G2As. في التحليل التمثيلي، يظهر تحليل تسلسل متحولة ZIP11 من Aedes aegypti.
يشير التصوير الكهربائي من مسوخ Aedes aegypti ZIP11 heterozygous إلى موضع النيوكليوتيدات حيث حدث ال indel. ويمثل indel من خلال التحول من قمم واحدة إلى مزدوجة كما تظهر المواقف متعددة الأشكال على حد سواء النيوكليوتيدات بما يصاحب ذلك. في نهاية التشغيل، تم حساب عدد الأزواج الأساسية المحذوفة أو المدرجة عن طريق حساب القمم المفردة.
البعوض الذي يحتوي على طفرات في الجينات Aedes aegypti ZIP11 وميو-fem تم كتابتها جينيا وتم التحقق منها تسلسلا باستخدام تحليل ذوبان عالي الدقة ل HRMA. وتم تطبيع الإشارات الفلورية للعينات إلى قيم نسبية تؤهن من واحد إلى صفر. بالإضافة إلى ذلك، تم طرح كل منحنى من مرجع النوع البرية ويدل على التكبير المقابل.
وتظهر عملية تعيين مجموعة تلقائية فاشلة في النتائج التمثيلية، حيث لم يتم التمييز بشكل سليم بين المجموعات. علاوة على ذلك، تم تحليل كل عينة بشكل فردي وتعيينها إلى المجموعات الصحيحة استنادا إلى التشابه مع العينات المرجعية من الهيتروزجوت، والهوزيغوت، وtransheterozygotes. بعد إجراء HRMAs ، تسلسل الحمض النووي من الأفراد المتحولين ضروري لتحليل indels وتحديد الطفرات الأخرى في التسلسل المستهدف.
