このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術によって生成された変異体を多数の個人から検出する非常にシンプルで効率的な方法です。この技術の2つの主な利点は、それが数時間で行うことができることと、それが多数の生物に適用できることです。プライマー設計は、特定の遺伝子に対して挑戦的であり、複数のプライマー設計と検証がHRMAを効率的にするために必要とされる場合がある。
勾配 PCR を実行するには、マスター ミックスを準備して開始します。次に、非テンプレートコントロール用のマスターミックスの19マイクロリットルまたは96ウェルプレートのNTCを取り除きます。次に、残りのマスター ミックスにテンプレートを追加します。
サンプルのアリコート20マイクロリットルは、96ウェルプレートに混合する。サイクリングパラメータに従ってPCRを実行し、原稿に記載されているパラメータを使用して熱溶融プロファイルを生成します。必要な材料をすべて集めた後、0.5マイクロリットルのDNA放出試薬と20マイクロリットルの希釈バッファーを遺伝子型にしてマスターミックスを調製します。
マルチチャネルピペットを使用して、20マイクロリットルの混合液をPCRプレートに組み込み、PCRプレートを氷の上に残します。次に、麻酔したG1蚊をガラスのペトリ皿に入れて鎮静させ、2番目のペトリ皿に8匹の野生型蚊を入れます。70%エタノールでピンセットのペアを拭き、消毒されたピンセットを使用して蚊の後ろ足の1つを取り除きます。
次いで、DNA放出試薬溶液中に脚を沈下する。対応するバイアルに蚊を入れ、スポンジでバイアルを閉じます。完了したら、ピンセットを70%エタノールで拭き取ってから、次の蚊から脚を取り除き、96ウェルプレートが完成するまで進みます。
その後、プレートを光学PCRプレートシールで密封し、脚を含むPCRプレートを室温で2〜5分間インキュベートし、続いて摂氏98度で2分間インキュベーションします。プレートを室温まで冷却します。PCRの場合は、好ましい成分を含むマスターミックスを準備し、マルチチャンネルピペットを使用して、マスターミックスの19マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに転送します。
以前に調製した蚊のDNAを含むDNA放出溶液の1マイクロリットルをプレートに移し、光学PCRプレートシールでプレートを密封する。適切なサイクリングパラメータを使用してPCRを実行し、原稿に記載されているパラメータに従って熱溶融プロファイルを生成し、次に野生型制御を参照クラスタに割り当てることで溶融プロファイルを調べます。96 ウェル テンプレートで、対応する色を使用して異なるクラスターをマークします。
次に、目的の曲線を持つ個人を選択し、選択した個人をチューブから取り除き、クロスを戻します。血液はそれを女性にし、続いてG2Aを採取した。代表的な分析では、Aedes aegyptiのZIP11変異体の配列解析が示されている。
Aedes aegypti ZIP11ヘテロ接合体からのエレクトロフェログラムは、インデルが発生したヌクレオチド位置を示した。インデルは、多形の位置が両方のヌクレオチドを併発して示すように、単一から二重のピークへのシフトによって表される。実行の最後に、削除または挿入された基本ペアの数は、単一のピークをカウントして計算されました。
Aedes aegypti ZIP11およびmyo-fem遺伝子に変異を含む蚊は、HRMAの高解像度メルト分析を用いて遺伝子型および配列化が検証された。サンプルの蛍光シグナルを1~0の相対値に正規化した。さらに、各曲線を野生型の参照から差し引き、対応する倍率を示しました。
グループ間で適切な区別が行われなかった代表的な結果には、失敗した自動クラスター割り当てが表示されます。また、各試料を個別に分析し、ヘテロ接合量、ホモ接合体、およびトランスヘテロ接合体のサンプルを参照する類似性に基づいて正しいグループに割り当てた。HRMを行った後、突然変異した個体からのDNAのシーケンシングは、インデルを分析し、標的配列内の他の突然変異を同定するために必要である。
