모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 돌연변이를 감지하는 매우 간단하고 효율적인 방법입니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 몇 시간 안에 수행 할 수 있으며 많은 유기체에 적용 가능하다는 것입니다. 특정 유전자에 도전적일 수 있는 프라이머 설계와 HRMA의 효율성을 높이는 데 여러 라운드의 프라이머 설계 및 검증이 필요할 수 있습니다.

그라데이션 PCR을 수행하려면 마스터 믹스를 준비하여 시작합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 비템플릿 제어 또는 NTC용 마스터 믹스의 19마이크로리터를 제거합니다. 그런 다음 나머지 마스터 믹스에 템플릿을 추가합니다.

96웰 플레이트에 샘플 믹스의 Aliquot 20 마이크로리터. 사이클링 매개 변수에 따라 PCR을 수행한 다음 원고에 언급된 매개 변수를 사용하여 열 용융 프로파일을 생성합니다. 필요한 모든 재료를 수집한 후, DNA 방출 시약의 0.5 마이크로리터와 20 마이크로리터의 유전자형을 가진 마스터 믹스를 준비한다.

멀티채널 파이프를 사용하여 믹스의 20 마이크로리터를 PCR 플레이트에 넣고 PCR 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 마취된 G1 모기를 유리 페트리 접시에 넣고 진정시키고 두 번째 페트리 접시에 8마리의 야생형 모기를 놓습니다. 70%에탄올로 핀셋 을 닦고 소독된 핀셋을 사용하여 모기 뒷다리 중 하나를 제거합니다.

그런 다음, DNA 방출 시약 용액에 다리를 침수. 모기를 해당 바이알에 놓고 스폰지로 유리병을 닫습니다. 완료되면 핀셋을 70%에탄올로 닦은 후 96웰 플레이트가 완성될 때까지 다음 모기에서 다리를 제거합니다.

나중에, 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 2 ~ 5 분 동안 실온에서 다리를 포함하는 PCR 플레이트를 인큐베이션한 다음 2 분 동안 98도에서 배양하십시오. 접시를 실온으로 식힙니다. PCR의 경우, 선호하는 구성 요소를 포함하는 마스터 믹스를 준비한 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스의 19마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰로 전송합니다.

이전에 준비된 모기 DNA를 함유한 DNA 방출 용액의 마이크로리터 1개를 플레이트로 옮은 후, 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉한다. 적절한 사이클링 파라미터로 PCR을 수행하여 원고에 설명된 매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성한 다음, 기준 클러스터에 야생식 컨트롤을 할당하여 용융 프로파일을 검사합니다. 96웰 템플릿에 해당 색상으로 다른 클러스터를 표시합니다.

다음으로, 관심의 곡선을 가진 개인을 선택하고 다시 십자가튜브에서 선택한 개인을 제거합니다. 혈액 공급 만든 그것은 여성, G2A를 수집 하 여 다음. 대표적인 분석에서 Aedes aegypti의 ZIP11 돌연변이의 서열 분석이 도시된다.

Aedes aegypti ZIP11 이종화구균 돌연변이체의 전전자페로그램은 인델이 발생한 뉴클레오티드 위치를 나타냈다. 다형성 위치가 두 뉴클레오티드를 모두 수반적으로 보여주면서 인델은 단일 에서 이중 피크로의 변화로 표현됩니다. 실행이 끝나면 단일 피크를 계산하여 삭제되거나 삽입된 기본 쌍의 수를 계산했습니다.

유전자Aedes aegypti ZIP11 및 myo-fem에 돌연변이를 포함하는 모기는 HRMA의 고해상도 용융 분석을 사용하여 유전자형 및 서열 확인하였다. 샘플의 형광 신호는 1대 0의 상대값으로 정규화되었다. 또한 각 곡선은 야생형 참조에서 빼고 해당 배율을 표시했습니다.

실패한 자동 클러스터 할당은 대표 결과에 표시되며 그룹 간의 적절한 구별이 이루어지지 않았습니다. 또한, 각 시료는 이종고트, 동형질및 트랜스헤터로지고테스의 참조 샘플에 대한 유사성에 기초하여 올바른 그룹에 개별적으로 분석되고 할당되었다. HRMA를 수행 한 후, 돌연변이 된 개인으로부터 DNA를 시퀀싱하면 인델을 분석하고 표적 서열에서 다른 돌연변이를 식별해야합니다.