Wie Axone durch die komplexe Matrix des zentralen Nervensystems navigieren, ist eine grundlegende Frage in der Neurobiologie. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in der physiologischen Umgebung mit hochauflösender Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt eine benutzerfreundliche End-to-End-Pipeline für die Abgabe von DNA in das embryonale Gehirn der Maus, Präparate für hochwertige organotypische Schnitte und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildaufnahme und -analyse.
Obwohl ursprünglich entwickelt, um die Axondynamik im embryonalen Zentralnervensystem zu untersuchen, konnte dieses Protokoll angepasst werden, um eine organotypische Kultur und Visualisierung der Axonplastizität nach traumatischen oder pathologischen Zuständen zu ermöglichen. Das Protokoll selbst ist relativ einfach. Das Erreichen der ersten Kennzeichnung und die Erhaltung von Gehirnstrukturen sind jedoch kritische Punkte.
Daher erfordern die Elektroporations-, Gehirndissektions- und Schneideschritte besondere Sorgfalt. Die Demonstration des Verfahrens wird hilfreich sein, und der Doktorand kommt aus dem Labor von Bracket. Machen Sie nach der Betäubung einer schwangeren weiblichen Maus einen Einschnitt, um beide Uterushörner mit einem Wattestäbchen herauszuziehen, der in warmer Kochsalzlösung oder Pinzette getränkt ist, und greifen Sie vorsichtig die Zwischenräume zwischen den Embryonen ein.
Legen Sie dann die Embryonen auf nasse Gaze. Nachdem Sie den Gebärmuttersack aufgeschnitten haben, entfernen Sie jeden Embryo. Geben Sie die Embryonen in eine 10 Zentimeter große Schale, die HBSS enthält, ergänzt mit Glukose auf Eis.
Für die Ex-utero-Elektroporation nehmen Sie einen Embryo auf und legen Sie ihn in den Halter. Führen Sie dann vorsichtig die Glaskapillare mit der DNA-Fast-Green-Mischung durch den Embryonenschädel in den lateralen Ventrikel ein und injizieren Sie zwei bis drei Mikroliter der DNA-Plasmidmischung in jeden Ventrikel. Als nächstes halten Sie den Kopf des Embryos zwischen Platinpinzettenelektroden im entsprechenden Winkel, um den gewünschten Gehirnbereich anzuvisieren, wobei die Kathode dem Bereich zugewandt ist, in dem der DNA-Transfer beabsichtigt ist.
Für die Elektroporation in utero, nachdem Sie die Uterushörner herausgezogen und die Embryonen auf eine nasse Gaze gelegt haben, wie zuvor gezeigt, verwenden Sie die Fingerspitzen, um den Embryo sanft in der Gebärmutter zu drehen, bis sich die lambdoidalen und saggitalen Nähte befinden. Führen Sie dann vorsichtig die Glaskapillare mit der DNA Fast Green Mix durch die Gebärmutterwand und den Embryonenschädel in den Seitenventrikel ein und injizieren Sie zwei bis drei Mikroliter der DNA-Plasmidmischung nach Belieben in einen oder beide Ventrikel mit maximal zwei Mikrolitern pro Ventrikel. Halten Sie nach der Injektion den Kopf des Embryos zwischen Platinpinzettenelektroden im entsprechenden Winkel, um den gewünschten Gehirnbereich mit der Kathode zu erreichen, die dem Bereich zugewandt ist, in dem der DNA-Transfer beabsichtigt ist.
Sobald alle erforderlichen Embryonen elektroporiert wurden, verwenden Sie eine salzhaltige Wattestäbchen, um die Uterushörner vorsichtig wieder in die Bauchhöhle zu legen. Nähen Sie die Muskel- und Hautschnitte mit 5-0-Nahtmaterial, sichern Sie dann die Wunde mit Nahtklammern und desinfizieren Sie die Wunde, indem Sie sie mit Betadin besprühen. Legen Sie die Maus zurück in den Erholungskäfig und halten Sie die Wärme mit einem Ferninfrarot-Wärmelicht für mindestens 20 Minuten nach dem Eingriff aufrecht.
Fixieren Sie den Kopf des Embryos unter einem Dissektionsmikroskop. Entfernen Sie dann die Haut im Schädel, indem Sie entlang der Mittellinie schneiden, beginnend von der Basis des Kopfes in Richtung Nase. Schälen Sie die Haut im Schädel seitlich und machen Sie eine ausreichend große Lücke, damit das Gehirn entfernt werden kann.
Als nächstes, um das Gehirn zu entfernen, setzen Sie die geschlossene Spitze der sterilen Dissektionsschere ein, die unter dem Riechkolben beginnt und sich in Richtung des Hirnstamms bewegt. Dann schneiden Sie den Hirnstamm ab und schneiden Sie viele lose Stücke von Hirnhäuten um das Gehirn herum. Nehmen Sie mit einem perforierten Löffel das Gehirn auf und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie den Boden des Löffels gegen trockenes Seidenpapier tupfen.
Dann legen Sie das Gehirn in eine Agaroseschale auf Eis. Als nächstes mischen Sie mit einem kleineren Löffel die Agarose für 10 Sekunden für eine gleichmäßige Abkühlung, dann manövrieren Sie das Gehirn in die Mitte der Schale, legen Sie sie horizontal mit der dorsalen Seite nach oben und stellen Sie sicher, dass sie vollständig mit Agarose aus allen Richtungen bedeckt ist. Nehmen Sie den Agaroseblock vorsichtig vom Vibratome-Arbeitsplatz auf und trocknen Sie den Boden, indem Sie gegen Seidenpapier tupfen.
Legen Sie dann den Block auf den geklebten Bereich des Probenhalters mit der rostralen Seite des Gehirns nach oben und legen Sie den Probenhalter auf Eis. Lassen Sie den Kleber eine Minute trocknen. Schneiden Sie das Gehirn in koronale Scheiben in einem Winkel von 15 Grad.
Sammeln Sie dann mit sauberen Spateln die Gehirnscheiben und legen Sie sie mit Parrafin auf eine PTFE-Membran, die in einer 35-Millimeter-Glasbodenschale immobilisiert ist. Sammeln Sie bis zu fünf Gehirnscheiben pro Membran. Als nächstes entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette die überschüssige HBSS-Glucoselösung aus der Nähe der Scheiben auf der Membran, wobei die Scheiben halbtrocken bleiben, dann fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmte Schichtmedien direkt in den Raum unter der Membran hinzu und inkubieren Sie die Scheiben bei 35 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Für die Bildgebung des Axonwachstums lokalisieren Sie eine Kortexregion mit niedriger bis mittlerer Zelldichte. Für die Abbildung der Wachstumskegeldynamik lokalisieren Sie einen Wachstumskegel in der unmittelbaren Zone oder subventrikulären Zone des Kortex. Als nächstes definieren Sie eine Z-Stack-Größe.
Für das Axonwachstum in einem großen Z-Stapel stellen Sie eine Schrittgröße von zwei Mikrometern ein und für Wachstumskegel in einem kleineren Z-Stapel eine Schrittgröße von einem Mikrometer. Öffnen Sie für die Datenanalyse die Bilddatei in Fidschi, indem Sie auf Datei klicken, dann öffnen und das Bild auswählen. Erhalten Sie die maximale Intensität der Projektion des Zeitraffers, indem Sie auf das Bild klicken, gefolgt von Stapeln, Z-Projektion und Projektion mit maximaler Intensität.
Gehen Sie durch den Zeitraffer und lokalisieren Sie ein wachsendes Axon. Zeichnen Sie nach dem Auffinden eine Linie durch das wachsende Axon, beginnend mit der Spitze des Axons im ersten Bild und dem Axon durch den gesamten Zeitraffer. Als nächstes singen Sie das Plugin kymo re-slice wide.
Legen Sie den Maßstab des Kymographen fest, indem Sie zu Bild und dann zu Eigenschaften gehen. Nachdem Sie den Abstand in Mikrometern und die Pixelbreite und die Zeit in Sekunden oder Minuten und die Pixelhöhe festgelegt haben, gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie auf Messen. Um das Volumen des Wachstumskegels zu messen, öffnen Sie die Bilddatei in der Bildanalysesoftware, indem Sie auf Datei klicken, öffnen und die gewünschte Datei auswählen.
Wählen Sie dann in Schritt eins unter Algorithmuseinstellungen die Option Nur einen Bereich von Interesse segmentieren aus, und schneiden Sie in Schritt zwei den Rahmen so zu, dass er in den gesamten Wachstumskegel in allen Frames passt. Als nächstes in Schritt drei, halten Sie die Schwelle auf absolute Intensität und in Schritt vier, stellen Sie sicher, dass die gesamte Wachstumskegelregion geschwemmt ist. Wählen Sie dann in Schritt fünf unter Filtertyp die Anzahl der Voxel LMG auf eins aus.
Wählen Sie die Schaltfläche Ausführen aus, um alle Erstellungsschritte auszuführen und den Assistenten zum Hinzufügen neuer Flächen zu beenden. Wählen Sie schließlich auf der Registerkarte Statistiken oben im Fenster des Assistenten bestimmte Werte und Volumes auf der Registerkarte "Detailliert" aus. Typischerweise zeigen erfolgreich kultivierte Gehirnschnitte, die entweder aus der In-utero- oder Ex-utero-Elektroporation stammen, eine normale zelluläre Verteilung und eine organisierte Anordnung radialer Gliazellen mit apikal orientierten Pilo-Kontaktierungsprozessen.
Gelegentlich werden eine Ex-utero-Elektroporation beobachtet, die Störungen im radialen Glia-Gerüst und kultivierten Hirnschnitten markiert, was diese Kontrollfärbung empfehlenswert macht. Ein repräsentatives pyramidenförmiges kortikales projizierendes Neuron, das Lyn-mNeonGreen exprimiert, und das dynamische Verhalten seines Wachstumskegels werden hier gezeigt. Zusätzlich wurden Neuronen mit einer plasmidexprimierenden Aktinsonde markiert, um die Aktindynamik von axonalen Wachstumskegeln in situ zu analysieren.
In-situ-Experimente wurden auch mit einem dualen Cre-Dre-Fluorophor-exprimierenden Plasmid-Design durchgeführt, bei dem tRFP- oder ZsGreen-Fluorophore spezifisch und individuell durch Dre- bzw. Cre-Rekombinasen in benachbarten Neuronen aktiviert werden konnten. Aus Kymographen werden dynamische Wachstumsparameter wie Wachstumsgeschwindigkeit für mehrere Axone und Wachstumskegelvolumen im Laufe der Zeit leicht gewonnen. Dies kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit des Aktinlaufbandes und das Gleichgewicht zwischen Filopodien und Lamellapodien während der Wachstumskegelerkundungsaktivität zu bewerten.
Es ist wichtig, die Gehirnstruktur aufrechtzuerhalten und die Plasmidkonzentrationen fein abzustimmen, um eine spärliche Markierung zu erreichen. Dies ist entscheidend für die genaue Visualisierung von Axonen und Wachstumskegeln im Kortex. Abhängig von den ausgewählten Plasmen und dem genetischen Hintergrund ermöglicht dieses Protokoll den Benutzern, Neuronen oder die Umgebung, in der sie wachsen, zu modifizieren, was eine breite Palette von Studien ermöglicht.
Durch die Ermöglichung eines hochauflösenden Zugangs zu Neuronen in situ ermöglicht diese Technik Neurowissenschaftlern, die dynamische Interaktion zwischen Wachstumskegeln und den Metriken des zentralen Nervensystems sowohl auf morphologischer als auch auf molekularer Ebene zu untersuchen.
