Aksonların karmaşık merkezi sinir sistemi matrisinde nasıl gezindiği, nörobiyolojide temel bir sorudur. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile fizyolojik ortamda akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerinin incelenmesini sağlar. Bu protokol, fare embriyonik beyninde DNA'nın verilmesi için kullanıcı dostu uçtan uca bir boru hattını, yüksek kaliteli organotipik dilimler için hazırlıkları ve görüntü elde etme ve analiz için adım adım bir kılavuzu açıklamaktadır.
Başlangıçta embriyonik merkezi sinir sistemindeki akson dinamiklerini incelemek için tasarlanmış olmasına rağmen, bu protokol organotipik kültüre ve travmatik veya patolojik durumlardan sonra akson plastisitesinin görselleştirilmesine izin verecek şekilde ayarlanabilir. Protokolün kendisi nispeten basittir. Bununla birlikte, ilk etiketlemesini ve beyin yapılarının korunmasını sağlamak kritik noktalardır.
Bu nedenle, elektroporasyon, beyin diseksiyonu ve dilimleme adımları ekstra özen gerektirir. Prosedürün gösterilmesi yardımcı olacaktır ve doktora öğrencisi Bracket'ın laboratuvarındandır. Hamile bir kadın fareyi uyuşturduktan sonra, embriyolar arasındaki boşlukları dikkatlice yakalayarak, ılık salin veya forsepslere batırılmış bir pamuk tomurcuğu kullanarak her iki uterus boynuzunu da çıkarmak için bir kesi yapın.
Sonra embriyoları ıslak gazlı bez üzerine yerleştirin. Rahim kesesini kestikten sonra açın, her embriyoyu çıkarın. Embriyoları, buz üzerinde glikoz ile desteklenmiş HBSS içeren 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin.
Ex utero elektroporasyon için, bir embriyo alın ve tutucuya yerleştirin. Daha sonra DNA hızlı yeşil karışımını içeren cam kılcal damarı embriyo kafatasından lateral ventriküle dikkatlice yerleştirin ve her ventriküle DNA plazmid karışımının iki ila üç mikrolitresini enjekte edin. Daha sonra, embriyonun kafasını platin cımbız elektrotları arasında, istenen beyin bölgesini hedeflemek için uygun açıda tutun, katot DNA transferinin amaçlandığı alana bakar.
In utero elektroporasyon için, uterus boynuzlarını çıkardıktan ve embriyoları daha önce gösterildiği gibi ıslak bir gazlı bez üzerine yerleştirdikten sonra, lambdoidal ve saggital sütürler yerleştirilene kadar embriyoyu uterusun içinde yavaşça döndürmek için parmak uçlarını kullanın. Daha sonra, DNA hızlı yeşil karışımını içeren cam kılcal damarı uterus duvarından ve embriyo kafatasından lateral ventriküle dikkatlice yerleştirin ve DNA plazmid karışımının iki ila üç mikrolitresini, ventrikül başına maksimum iki mikrolitre ile istenildiği gibi bir veya iki ventriküle enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, embriyonun kafasını platin cımbız elektrotları arasında uygun açıda tutun ve istenen beyin bölgesini hedef almak için katot DNA transferinin amaçlandığı alana bakar.
Gerekli tüm embriyolar elektroporasyondan sonra, uterus boynuzlarını nazikçe karın boşluğunun içine yerleştirmek için tuzlu suyla ıslatılmış bir pamuk tomurcuğu kullanın. Kas ve cilt kesilerini 5-0 dikiş malzemesi kullanarak dikişleyin, ardından dikiş klipslerini kullanarak yarayı sabitleyin ve betadin püskürterek yarayı dezenfekte edin. Fareyi kurtarma kafesine geri yerleştirin ve işlem sonrası en az 20 dakika boyunca uzak bir kızılötesi ısıtma ışığı kullanarak sıcaklığı koruyun.
Embriyonun kafasını diseksiyon mikroskobu altında sabitleyin. Daha sonra kafatasındaki deriyi, başın tabanından başlayarak buruna doğru orta hat boyunca keserek çıkarın. Kafatasındaki cildi yanal olarak soyun, beynin eksize edilmesi için yeterince büyük bir boşluk bırakın.
Daha sonra, beyni çıkarmak için, koku alma ampulünün altından başlayıp beyin sapına doğru hareket eden steril diseksiyon makaslarının kapalı ucunu yerleştirin. Sonra beyin sapını kesin ve beynin etrafındaki birçok gevşek meninks parçasını kesin. Delikli bir kaşık kullanarak beyni alın ve kaşığın altını kuru mendil kağıdına batırarak fazla sıvıyı çıkarın.
Sonra beyni buz üzerinde bir agaroz kabına yerleştirin. Daha sonra, daha küçük bir kaşık kullanarak agarozu soğutmak için 10 saniye boyunca karıştırın, ardından beyni sırt tarafı yukarı doğru yatay olarak yerleştirerek ve her yönden tamamen agarozla kaplanmasını sağlayarak kabın ortasına doğru manevra yapın. Agaroz bloğunu Vibratome iş istasyonundan yavaşça alın ve kağıt mendile vurarak tabanı kurulayın.
Daha sonra bloğu numune tutucunun yapıştırılmış alanına, beynin rostral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve numune tutucuyu buzun üzerine koyun. Tutkalın bir dakika kurumasını bekleyin. Beyni koronal dilimler halinde 15 derecelik bir açıyla kesin.
Daha sonra temiz spatulalar kullanarak, beyin dilimlerini toplayın ve Parrafin kullanarak 35 milimetrelik bir cam alt kapta hareketsiz hale getirilmiş bir PTFE membranına yerleştirin. Membran başına beş adede kadar beyin dilimi toplayın. Daha sonra, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, fazla HBSS glikoz çözeltisini membran üzerindeki dilimlerin etrafından çıkarın ve dilimleri yarı kuru bırakın, ardından 500 mikrolitre önceden ısıtılmış dilim ortamını doğrudan membranın altındaki boşluğa ekleyin ve dilimleri% 5 karbondioksit ile 35 santigrat derecede inkübe edin.
Akson büyümesini görüntülemek için, düşük ila orta hücre yoğunluğuna sahip bir korteks bölgesi bulun. Büyüme konisi dinamiklerini görüntülemek için, korteksin hemen bölgesinde veya subventriküler bölgesinde bir büyüme konisi bulun. Ardından bir Z yığını boyutu tanımlayın.
Büyük bir Z yığınında akson büyümesi için, iki mikrometrelik bir adım boyutu ayarlayın ve daha küçük bir Z yığınındaki büyüme konileri için bir mikrometrelik bir adım boyutu ayarlayın. Veri analizi için, dosya'yı tıklatıp açıp görüntüyü seçerek görüntü dosyasını Fiji'de açın. Görüntüye tıklayarak zaman atlamasının maksimum yoğunluk projeksiyonunu, ardından yığınlar, Z projeksiyonu ve maksimum yoğunluk projeksiyonunu elde edin.
Zaman atlamalı yoldan geçin ve büyüyen bir akson bulun. Yerleştirildikten sonra, ilk karedeki aksonun ucundan başlayarak ve aksonu tüm zaman atlaması boyunca takip ederek büyüyen akson boyunca bir çizgi çizin. Ardından, eklenti kymo re-slice genişliğinde şarkı söyleyin.
Görüntüye, ardından özelliklere giderek kimografın ölçeğini ayarlayın. Mesafeyi mikrometre ve piksel genişliğini ve saniye veya dakika cinsinden süreyi ve piksel yüksekliğini ayarladıktan sonra analiz etmeye gidin ve ölçüye tıklayın. Büyüme konisinin hacmini ölçmek için, dosyayı tıklatıp açıp ilgilendiğiniz dosyayı seçerek görüntü dosyasını görüntü analiz yazılımında açın.
Ardından, birinci adımda yeni yüzeyler ekleme sihirbazını seçin, algoritma ayarları altında yalnızca ilgilenilen bir bölgeyi segmentlere ayır'ı seçin ve ikinci adımda, çerçeveyi tüm çerçevelerdeki tüm büyüme konisine sığacak şekilde kırpın. Üçüncü adımda, eşiği mutlak yoğunluğa tutun ve dördüncü adımda, tüm büyüme konisi bölgesinin eşik olduğundan emin olun. Daha sonra beşinci adımda, filtre türü altında LMG voksel sayısını bire seçin.
Tüm oluşturma adımlarını gerçekleştirmek ve yeni yüzeyler ekleme sihirbazını sonlandırmak için yürüt düğmesini seçin. Son olarak, sihirbaz penceresinin üst kısmındaki istatistikler sekmesinde, ayrıntılı sekmenin altındaki belirli değerleri ve hacmi seçin. Tipik olarak, in utero veya ex utero elektroporasyondan türetilen başarılı bir şekilde kültürlenmiş beyin dilimleri, normal hücresel dağılımı ve apikal yönelimli pilo ile temas eden süreçlere sahip organize bir radyal glia dizisini gösterir.
Bazen radyal glial iskelede ex utero elektroporasyon belirgin bozukluklar gözlenir ve kültürlenmiş beyin dilimleri bu kontrol boyamasını tavsiye eder. Lyn-mNeonGreen'i ve büyüme konisinin dinamik davranışını ifade eden temsili bir piramidal kortikal projeksiyon nöronu burada gösterilmiştir. Ek olarak, nöronlar, aksonal büyüme konilerinin in situ aktin dinamiklerini analiz etmek için aktin probu eksprese eden bir plazmid kullanılarak etiketlendi.
In situ deneyler ayrıca, tRFP veya ZsGreen floroforlarının, komşu nöronlarda sırasıyla dre veya cre rekombinazları tarafından spesifik ve bireysel olarak aktive edilebildiği plazmid tasarımını ifade eden bir çift cre dre florophore ile gerçekleştirildi. Kimografilerden, birkaç akson için büyüme hızı ve zaman içindeki büyüme konisi hacmi gibi dinamik büyüme parametreleri kolayca elde edilir. Bu, aktin koşu bandının hızını ve büyüme konisi keşif aktivitesi sırasında filopodia ve lamellapodia arasındaki dengeyi değerlendirmek için kullanılabilir.
Seyrek etiketleme elde etmek için beyin yapısını korumak ve plazmid konsantrasyonlarına ince ayar yapmak önemlidir. Bu, korteksteki aksonların ve büyüme konilerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesi için çok önemlidir. Seçilen plazmalara ve genetik arka plana bağlı olarak, bu protokol kullanıcıların nöronları veya içinde büyüdükleri ortamı değiştirmelerine izin vererek çok çeşitli çalışmalara izin verir.
Bu teknik, in situ nöronlara yüksek çözünürlüklü erişim sağlayarak, sinirbilimcilerin büyüme konileri ile merkezi sinir sistemi metrikleri arasındaki dinamik etkileşimi hem morfolojik hem de moleküler seviyelerde sorgulamalarını sağlar.
