באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

כיצד אקסונים מנווטים את מטריצת מערכת העצבים המרכזית המורכבת היא שאלה בסיסית בנויירוביולוגיה. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את גדילת האקסון ואת דינמיקת חרוט הצמיחה בסביבה הפיזיולוגית עם הדמיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר צינור ידידותי למשתמש מקצה לקצה להעברת דנ"א במוח העוברי של העכבר, הכנות לפרוסות אורגנוטיפיות באיכות גבוהה ומדריך צעד אחר צעד לרכישה וניתוח תמונה.

למרות שתוכנן במקור לחקור את הדינמיקה של אקסון במערכת העצבים המרכזית העוברית, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר תרבות אורגנוטיפית והדמיה של פלסטיות אקסון לאחר מצבים טראומטיים או פתולוגיים. הפרוטוקול עצמו פשוט יחסית. עם זאת, השגת הסימון הראשון שלה ושימור של מבנים מוחיים הם נקודות קריטיות.

לכן, שלבי האלקטרופורציה, כריתת המוח והחיתוך דורשים טיפול נוסף. הדגמת ההליך תועיל, והדוקטורנטית היא מהמעבדה של Bracket. לאחר שהרדימו עכבר נקבה בהריון, עשו חתך כדי לשלוף את שתי קרני הרחם באמצעות ניצן כותנה ספוג במי מלח חמים או מלקחיים, ותפסו בזהירות את הרווחים בין העוברים.

לאחר מכן מניחים את העוברים על גזה רטובה. לאחר חיתוך פתיחת שק הרחם, הסר כל עובר. מניחים את העוברים בצלחת של 10 ס"מ המכילה HBSS בתוספת גלוקוז על קרח.

עבור אלקטרופורציה של רחם לשעבר, הרימו עובר והניחו אותו במחזיק. לאחר מכן החדירו בזהירות את נימי הזכוכית המכילים את התערובת הירוקה המהירה של הדנ"א דרך גולגולת העובר לתוך החדר הצדדי, והזיקו שניים עד שלושה מיקרוליטרים של תערובת פלסמיד הדנ"א לכל חדר. לאחר מכן, החזק את ראש העובר בין אלקטרודות פינצטה פלטינה בזווית המתאימה כדי לכוון לאזור המוח הרצוי, כאשר הקתודה פונה לאזור שאליו מיועדת העברת הדנ"א.

שכן באלקטרופורציה של רחם, לאחר משיכת קרני הרחם והנחת העוברים על גזה רטובה כפי שהוכח קודם לכן, השתמש בקצות האצבעות כדי לסובב בעדינות את העובר בתוך הרחם עד לאיתור התפרים הלמבדואידליים והסגיטליים. לאחר מכן החדירו בזהירות את נימי הזכוכית המכילים את התערובת הירוקה המהירה של הדנ"א דרך דופן הרחם וגולגולת העובר לתוך החדר הצדדי, והזיקו שניים עד שלושה מיקרוליטרים של תערובת הפלסמידים של הדנ"א לתוך אחד מהחדרים או שניהם לפי הצורך עם מקסימום של שני מיקרוליטרים לכל חדר. לאחר ההזרקה, החזק את ראש העובר בין אלקטרודות פינצטה פלטינה בזווית המתאימה כדי לכוון את אזור המוח הרצוי כאשר הקתודה פונה לאזור שאליו מיועדת העברת הדנ"א.

לאחר שכל העוברים הנדרשים עברו אלקטרופורציה, השתמשו בניצן כותנה ספוג מלוח כדי להניח בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן. לתפור את חתכי השריר והעור באמצעות 5-0 חומר תפר, ואז לאבטח את הפצע באמצעות קליפסים תפרים, ולחטא את הפצע על ידי ריסוסו עם בטאדין. הניחו את העכבר בחזרה בכלוב ההתאוששות ושמרו על חום באמצעות נורית התחממות אינפרה-אדומה רחוקה למשך 20 דקות לפחות לאחר ההחלמה.

לתקן את ראש העובר תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן הסר את העור בגולגולת על ידי חיתוך לאורך קו האמצע החל מבסיס הראש לכיוון האף. מקלפים את העור בגולגולת לרוחב ויוצרים מרווח גדול מספיק כדי שהמוח יוסר.

לאחר מכן, כדי להסיר את המוח להכניס את הקצה הסגור של מספריים דיסקציה סטרילית מתחילים מתחת לנורת חוש הריח ונעים לכיוון גזע המוח. לאחר מכן חתכו את גזע המוח וחתכו פיסות רבות של קרום המוח בצורה רופפת סביב המוח. באמצעות כפית מחוררת, מרימים את המוח ומסירים את הנוזל העודף על ידי דשדוש תחתית הכף כנגד נייר טישו יבש.

לאחר מכן הניחו את המוח בצלחת אגרוזה על קרח. לאחר מכן, באמצעות כפית קטנה יותר מערבבים את האגרוז במשך 10 שניות לקירור אחיד, ואז מתמרנים את המוח לאמצע המנה מניחים אותו אופקית עם הצד הגבי למעלה ומבטיחים שהוא מכוסה לחלוטין באגרוז מכל הכיוונים. הרימו בעדינות את גוש האגרוס מתחנת העבודה של Vibratome ויבשו את החלק התחתון על ידי דשדוש נייר טישו.

לאחר מכן הניחו את הבלוק על האזור המודבק של מחזיק הדגימה כשהצד הרוסטרלי של המוח פונה כלפי מעלה, והניחו את מחזיק הדגימה על הקרח. אפשרו לדבק להתייבש למשך דקה אחת. חותכים את המוח לפרוסות קורונליות בזווית של 15 מעלות.

לאחר מכן, באמצעות מריתות נקיות, אספו את פרוסות המוח והניחו אותן על קרום PTFE המשותק בצלחת תחתונה מזכוכית בקוטר 35 מילימטרים באמצעות Parrafin. אספו עד חמש פרוסות מוח לכל ממברנה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר מסירים את תמיסת הגלוקוז העודפת HBSS מסביב לפרוסות על הממברנה ומשאירים את הפרוסות יבשות למחצה, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיית פרוסות מוכנות מראש ישירות לחלל שמתחת לממברנה ומדגרים את הפרוסות ב-35 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

להדמיית גדילת אקסון, אתרו אזור קליפת המוח עם צפיפות תאים נמוכה עד בינונית. בעוד להדמיית דינמיקת חרוט גדילה, אתר חרוט גדילה באזור המיידי או באזור התת-חדרי של קליפת המוח. לאחר מכן הגדר גודל מחסנית Z.

לצמיחת אקסון בערימת Z גדולה, קבעו גודל צעד של שני מיקרומטרים ועבור מדוכים לצמיחה בערימת Z קטנה יותר, קבעו גודל צעד של מיקרומטר אחד. לניתוח נתונים, פתח את קובץ התמונה בפיג'י על-ידי לחיצה על הקובץ, לאחר מכן פתח ובחירת התמונה. השג את ההקרנה בעוצמה המרבית של חלוף הזמן על ידי לחיצה על התמונה, ואחריה ערימות, הקרנת Z והקרנת עוצמה מקסימלית.

עברו את פגרת הזמן ואתרו אקסון הולך וגדל. לאחר המיקום, ציירו קו דרך האקסון הגדל, החל מקצה האקסון במסגרת הראשונה ועקבו אחר האקסון לאורך כל פגרת הזמן. לאחר מכן, שרים את התוסף kymo פרוס מחדש לרוחב.

הגדר את קנה המידה של הקימוגרף על ידי מעבר לתמונה, ולאחר מכן מאפיינים. לאחר הגדרת המרחק במיקרומטרים, ורוחב הפיקסלים והזמן בשניות או דקות, וגובה הפיקסל, עבור לניתוח ולחיצה על מדידה. כדי למדוד את עוצמת הקול של חרוט הצמיחה, פתח את קובץ התמונה בתוכנת ניתוח התמונה על ידי לחיצה על קובץ, פתח ובחירת הקובץ המעניין.

לאחר מכן, בחר את אשף הוספת משטחים חדשים בשלב הראשון, תחת הגדרות אלגוריתם, בחר מקטע רק אזור מעניין, ובשלב השני, חתך את המסגרת כך שתתאים לכל חרוט הצמיחה בכל המסגרות. בשלב הבא בשלב השלישי, שמור על הסף בעוצמה מוחלטת ובשלב הרביעי, ודא שכל אזור חרוט הצמיחה נמצא בסף. ואז בשלב החמישי, תחת סוג מסנן בחר מספר voxels LMG לאחד.

בחר בלחצן הפעלה כדי לבצע את כל שלבי היצירה וסיים את אשף הוספת משטחים חדשים. לבסוף, בכרטיסיה נתונים סטטיסטיים בחלק העליון של חלון האשף, בחר ערכים ונפח ספציפיים תחת הכרטיסייה המפורטת. בדרך כלל, פרוסות מוח מתורבתות בהצלחה שמקורן באלקטרופורציה של רחם או אקס רחם מראות התפלגות תאית תקינה ומערך מאורגן של גליה רדיאלית עם תהליכי מגע פילו מכוונים.

לעיתים נצפו אלקטרופורציה של אקס רחם המסומנת בהפרעות בפיגומי הגליה הרדיאליים ובפרוסות המוח המתורבתות, מה שהופך את צביעת הבקרה הזו לזמינה. נוירון פירמידאלי מקרין קליפת המוח הייצוגי המבטא את Lyn-mNeonGreen ואת ההתנהגות הדינמית של חרוט הגדילה שלו מוצג כאן. בנוסף, תאי עצב סומנו באמצעות גשושית פלסמיד המבטאת אקטין כדי לנתח את הדינמיקה של אקטין של אצטרובלים של גדילה אקסונאלית באתרם.

ניסויים באתרם בוצעו גם עם פלואורופור כפול של cre dre המבטא תכנון פלסמידי, שבו tRFP או ZsGreen fluorophores יכולים להיות מופעלים באופן ספציפי ובנפרד על ידי רקומבינאזות dre או cre, בהתאמה בתאי עצב שכנים. מתוך קימוגרפים, פרמטרי צמיחה דינמיים כגון מהירות גדילה עבור מספר אקסונים ונפח חרוט גדילה לאורך זמן מתקבלים בקלות. ניתן להשתמש בכך כדי להעריך את המהירות של הליכון אקטין ואת האיזון בין פילופודיה ללמלפודיה במהלך פעילות חקר חרוט גדילה.

חשוב לשמור על מבנה המוח ולכוונן את ריכוזי הפלסמידים כדי להשיג תיוג דליל. זה חיוני להדמיה מדויקת של אקסונים ומדוכים גדילה בקליפת המוח. בהתאם לפלזמות הנבחרות ולרקע הגנטי, פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים לשנות נוירונים או את הסביבה שבה הם גדלים ומאפשר מגוון רחב של מחקרים.

על ידי מתן גישה ברזולוציה גבוהה לנוירונים באתרם, טכניקה זו מאפשרת למדעני מוח לחקור את האינטראקציה הדינמית בין אצטרובלים גדילה לבין מדדי מערכת העצבים המרכזית הן ברמה המורפולוגית והן ברמה המולקולרית.