Come gli assoni navigano nella complessa matrice del sistema nervoso centrale è una domanda fondamentale in neurobiologia. Questo protocollo consente lo studio della crescita degli assoni e della dinamica dei coni di crescita nell'ambiente fisiologico con imaging ad alta risoluzione. Questo protocollo descrive una pipeline end-to-end di facile utilizzo per la consegna del DNA nel cervello embrionale del topo, preparazioni per fette organotipiche di alta qualità e una guida passo passo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
Sebbene originariamente progettato per studiare la dinamica degli assoni nel sistema nervoso centrale embrionale, questo protocollo potrebbe essere regolato per consentire la coltura organotipica e la visualizzazione della plasticità assonale dopo condizioni traumatiche o patologiche. Il protocollo stesso è relativamente semplice. Tuttavia, raggiungere la sua prima etichettatura e conservazione delle strutture cerebrali sono punti critici.
Pertanto, l'elettroporazione, la dissezione del cervello e le fasi di affettamento richiedono una cura extra. Dimostrare la procedura sarà utile e lo studente di dottorato proviene dal laboratorio di Bracket. Dopo aver anestetizzato una topa femmina incinta, fare un'incisione per estrarre entrambe le corna uterine usando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina calda o pinza, afferrando con cura gli spazi tra gli embrioni.
Quindi posizionare gli embrioni su una garza bagnata. Dopo aver tagliato aprire il sacco uterino, rimuovere ogni embrione. Metti gli embrioni in un piatto di 10 centimetri contenente HBSS integrato con glucosio su ghiaccio.
Per l'elettroporazione ex utero, prendi un embrione e mettilo nel supporto. Quindi inserire con attenzione il capillare di vetro contenente la miscela verde veloce del DNA attraverso il cranio dell'embrione nel ventricolo laterale e iniettare da due a tre microlitri della miscela di plasmidi del DNA in ciascun ventricolo. Quindi, tenere la testa dell'embrione tra gli elettrodi della pinzetta di platino all'angolo appropriato per colpire l'area cerebrale desiderata, con il catodo rivolto verso l'area in cui è previsto il trasferimento del DNA.
Per l'elettroporazione in utero, dopo aver estratto le corna uterine e posizionato gli embrioni su una garza bagnata come dimostrato in precedenza, utilizzare la punta delle dita per ruotare delicatamente l'embrione all'interno dell'utero fino a quando non si trovano le suture lambdoidali e saggitali. Quindi inserire con attenzione il capillare di vetro contenente la miscela verde veloce del DNA attraverso la parete uterina e il cranio dell'embrione nel ventricolo laterale e iniettare da due a tre microlitri della miscela di plasmidi del DNA in uno o entrambi i ventricoli come desiderato con un massimo di due microlitri per ventricolo. Dopo l'iniezione, tenere la testa dell'embrione tra gli elettrodi della pinzetta di platino all'angolo appropriato per colpire l'area cerebrale desiderata con il catodo rivolto verso l'area in cui è previsto il trasferimento del DNA.
Una volta che tutti gli embrioni richiesti sono stati elettroporati, utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina per posizionare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale. Suturare le incisioni muscolari e cutanee utilizzando materiale di sutura 5-0, quindi fissare la ferita con clip di sutura e disinfettare la ferita spruzzandola con betadine. Riposizionare il mouse nella gabbia di recupero e mantenere il calore utilizzando una luce di riscaldamento a infrarossi lontani per almeno 20 minuti dopo la procedura.
Fissare la testa dell'embrione sotto un microscopio di dissezione. Quindi rimuovere la pelle nel cranio tagliando lungo la linea mediana partendo dalla base della testa verso il naso. Sbucciare la pelle nel cranio lateralmente creando uno spazio abbastanza grande da poter essere asportato dal cervello.
Successivamente, per rimuovere il cervello inserire la punta chiusa di forbici di dissezione sterili che iniziano sotto il bulbo olfattivo e si muovono verso il tronco cerebrale. Quindi tagliare il tronco cerebrale e tagliare molti pezzi sciolti di meningi intorno al cervello. Usando un cucchiaio perforato, raccogli il cervello e rimuovi il liquido in eccesso tamponando il fondo del cucchiaio contro la carta velina secca.
Quindi metti il cervello in un piatto di agarosio sul ghiaccio. Successivamente, usando un cucchiaio più piccolo mescolare l'agarosio per 10 secondi per un raffreddamento uniforme, quindi manovrare il cervello al centro del piatto posizionandolo orizzontalmente con il lato dorsale verso l'alto e assicurandosi che sia completamente coperto di agarosio da tutte le direzioni. Prelevare delicatamente il blocco di agarosio dalla postazione di lavoro Vibratome e asciugare il fondo tamponando la carta velina.
Quindi posizionare il blocco sull'area incollata del supporto del campione con il lato rostrale del cervello rivolto verso l'alto e mettere il supporto del campione sul ghiaccio. Lasciare asciugare la colla per un minuto. Tagliare il cervello a fette coronali con un angolo di 15 gradi.
Quindi, utilizzando spatole pulite, raccogliere le fette di cervello e posizionarle su una membrana di PTFE immobilizzata in un piatto di fondo di vetro da 35 millimetri usando Parrafin. Raccogli fino a cinque fette di cervello per membrana. Successivamente, utilizzando una pipetta da 200 microlitri rimuovere la soluzione di glucosio HBSS in eccesso da intorno alle fette sulla membrana lasciando le fette semi asciutte, quindi aggiungere 500 microlitri di slice media preriscaldata direttamente nello spazio sotto la membrana e incubare le fette a 35 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Per l'imaging della crescita degli assoni, individuare una regione della corteccia con densità cellulare da bassa a media. Mentre per l'imaging della dinamica del cono di crescita, individuare un cono di crescita nella zona immediata della corteccia o nella zona subventricolare. Quindi definire una dimensione dello stack Z.
Per la crescita degli assoni in una grande pila Z, impostare una dimensione del gradino di due micrometri e per i coni di crescita in una pila Z più piccola, impostare una dimensione del gradino di un micrometro. Per l'analisi dei dati, aprire il file immagine in Figi facendo clic su file, quindi apri e selezionando l'immagine. Ottieni la proiezione di massima intensità del time lapse facendo clic sull'immagine, seguita da pile, proiezione Z e proiezione di massima intensità.
Passa attraverso il lasso di tempo e individua un assone in crescita. Una volta individuato, disegna una linea attraverso l'assone in crescita, partendo dalla punta dell'assone nel primo fotogramma e seguendo l'assone per tutto il lasso di tempo. Quindi, canta il plugin kymo re-slice wide.
Imposta la scala del kymograph andando su image, quindi su properties. Dopo aver impostato la distanza in micrometri, la larghezza dei pixel e il tempo in secondi o minuti e l'altezza dei pixel, vai ad analizzare e fai clic su Misura. Per misurare il volume del cono di crescita, aprire il file di immagine nel software di analisi delle immagini facendo clic su file, apri e selezionando il file di interesse.
Quindi, selezionate la procedura guidata Aggiungi nuove superfici nel primo passaggio, in Impostazioni algoritmo, selezionate segmenta solo una regione di interesse e, nel secondo passaggio, ritagliate la cornice per adattarla all'intero cono di crescita in tutti i fotogrammi. Successivamente, nel terzo passaggio, mantenere la soglia all'intensità assoluta e nel passaggio quattro, assicurarsi che l'intera regione del cono di crescita sia thresholded. Quindi nel passaggio cinque, sotto il tipo di filtro selezionare il numero di voxel LMG a uno.
Selezionate il pulsante Esegui per eseguire tutti i passaggi di creazione e terminare la procedura guidata Aggiungi nuove superfici. Infine, nella scheda Statistiche nella parte superiore della finestra della procedura guidata, selezionare valori e volumi specifici nella scheda dettagliata. Tipicamente, le fette di cervello coltivate con successo derivate dall'elettroporazione in utero o ex utero mostrano una normale distribuzione cellulare e una serie organizzata di glia radiale con processi di contatto pilo orientati apicalmente.
Occasionalmente si osserva un'elettroporazione ex utero marcata disturbi nell'impalcatura gliale radiale e fette di cervello coltivate che rendono raccomandabile questa colorazione di controllo. Un neurone proiettante corticale piramidale rappresentativo che esprime Lyn-mNeonGreen e il comportamento dinamico del suo cono di crescita è mostrato qui. Inoltre, i neuroni sono stati etichettati utilizzando una sonda di actina che esprime il plasmide per analizzare le dinamiche dell'actina dei coni di crescita assonale in situ.
Sono stati eseguiti anche esperimenti in situ con un fluoroforo dual cre dre che esprime il design del plasmide, in cui i fluorofori tRFP o ZsGreen potrebbero essere attivati in modo specifico e individuale da dre o cre ricombinasi, rispettivamente nei neuroni vicini. Dai kymografi si ottengono facilmente parametri di crescita dinamica come la velocità di crescita per diversi assoni e il volume del cono di crescita nel tempo. Questo può essere utilizzato per valutare la velocità del tapis roulant dell'actina e l'equilibrio tra filopodia e lamellapodia durante l'attività di esplorazione del cono di crescita.
È importante mantenere la struttura del cervello e mettere a punto le concentrazioni di plasmidi per ottenere un'etichettatura sparsa. Questo è fondamentale per una visualizzazione accurata degli assoni e dei coni di crescita nella corteccia. A seconda dei plasmi selezionati e del background genetico, questo protocollo consente agli utenti di modificare i neuroni o l'ambiente in cui crescono consentendo una vasta gamma di studi.
Consentendo l'accesso ad alta risoluzione ai neuroni in situ, questa tecnica consente ai neuroscienziati di interrogare l'interazione dinamica tra i coni di crescita e le metriche del sistema nervoso centrale sia a livello morfologico che molecolare.
