تسمح هذه الطريقة للباحثين بتحديد الظروف المثلى لنبض التثقيب الكهربائي لنوع الخلية المطلوب ، مع تقليل الحاجة إلى النهج التجريبي التجريبي التقليدي. تستخدم هذه الطريقة تقنيات التثقيب الكهربائي الدقيق لتصنيع جهاز تشغيل الموائع الدقيقة القابل للتطوير والقادر على مراقبة درجة نفاذية غشاء الخلية كهربائيا طوال عملية التثقيب الكهربائي. سيوضح الإجراء كيشانكومار بوشا ، طالب ماجستير من مختبري.
للبدء ، قم بتثبيت رقاقة السيليكون في ظرف طلاء دوران الرقاقة باستخدام نظام تفريغ مغلف الدوران. ثم قم ببرمجة الدوار. بعد ذلك ، قم بتوزيع أربعة ملليلتر من مقاومة الصور SU-8 2010 على مركز رقاقة السيليكون وقم بتشغيل البرنامج.
بمجرد توقف النظام ، قم بإيقاف تشغيل الفراغ. ثم قم بتأمين قناع الصورة بتصميمات قناة الموائع الدقيقة 2D على حامل القناع وأدخل رقاقة السيليكون مع طلاء SU-8 متجها لأعلى على ظرف الرقاقة. اضبط إعدادات التعريض الضوئي ل 150 مللي جول لكل سنتيمتر مربع وقم بتشغيل الجهاز.
بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، اغمر رقاقة السيليكون في محلول مطور SU-8 مع تحريض لطيف لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. ثم قم بإزالة الرقاقة من المحلول وشطف السطح باستخدام الأيزوبروبانول. بعد ذلك ، ضع رقاقة السيليكون في فرن 150 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للخبز الصلب.
ثم اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام قياس ملامح القلم لقياس الارتفاع والانحدار الدقيق للجدران الجانبية للقناة. بعد ذلك ، قم بتوزيع ملليلتر واحد من مقاومة الصور على سطح الشريحة الزجاجية وقم بتشغيل البرنامج مرة أخرى. بمجرد توقف النظام ، قم بإيقاف تشغيل الفراغ وإزالة الشريحة الزجاجية.
بعد تأمين قناع الصورة بتصميمات القطب 2D على حامل القناع ، أدخل الرقاقة الزجاجية وقم بمحاذاتها مع طلاء S-1818 المواجه لأعلى على ظرف الرقاقة. اضبط إعدادات التعريض الضوئي على 215 مللي جول لكل سنتيمتر مربع وقم بتشغيل الجهاز. بعد التعرض ، غمر الشريحة الزجاجية في حل مطور MF-319 لمدة دقيقتين ، مع تطبيق التحريض اللطيف.
ثم قم بإزالة الرقاقة الزجاجية وشطف سطحها بالماء منزوع الأيونات. أخيرا ، ضع الشريحة الزجاجية في فرن 150 درجة مئوية للخبز الصلب ، مما يضمن أن سطح الركائز محل الاهتمام متجها لأعلى. بعد 30 دقيقة ، أخرج الشريحة من الفرن وحمايتها من الضوء.
لحفر الشريحة الزجاجية ، قم بغمرها في محلول حمض الهيدروفلوريك المخزن من 10 إلى 1 لمدة دقيقة واحدة في حاوية بولي تترافلورو إيثيلين. ثم انقل وغسل الشرائح الزجاجية في ماء منزوع الأيونات ثلاث مرات. بعد ذلك ، باستخدام نظام ترسيب البخار المادي ، يقوم برش التيتانيوم لمدة ثماني دقائق بمعدل 100 أنغستروم في الدقيقة والبلاتين لمدة 10 دقائق بمعدل 200 أنغستروم في الدقيقة.
ثم لرفع مقاومة الصورة ، اغمر الشرائح الزجاجية المطلية بالمعدن في حمام الأسيتون لمدة 10 دقائق وقم بصوتنة الحمام لإدخال الإثارة. إذا لزم الأمر ، استخدم منديلا منقوعا بالأسيتون لإزالة أي بقايا. التالي لصب نسخة طبق الأصل polydimethylsiloxane يجعل قاعدة المطاط الصناعي PDMS مع مادة صلبة بنسبة وزن 10 إلى 1 في حاوية يمكن التخلص منها موضوعة فوق ميزان إلكتروني.
ثم صب محلول PDMS فوق رقاقة السيليكون ووضع الخليط تحت فراغ لإزالة فقاعات الهواء. بعد معالجة الخليط عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن أربع ساعات ، استخدم طرف شفرة الحلاقة لقطع PDMS المصبوب وتقشيره من رقاقة السيليكون. ثم باستخدام لكمة خزعة حادة ، قم بإزالة PDMS من مدخل ومنافذ الجهاز.
بعد ذلك ، قم ببرمجة مولد البلازما لربط PDMS. ثم ضع PDMS وشريحة زجاج القطب في النظام مع توجيه الميزات لأعلى وتشغيل البرنامج. بعد اكتمال البرنامج ، قم بإزالة الأجهزة واستخدم مجسما لمحاذاة ميزات القناة بسرعة مع الأقطاب الكهربائية.
قم بالضغط بقوة من مركز PDMS باتجاه الجانبين لإزالة أي فقاعات هواء غير مرغوب فيها في واجهة الترابط. حصاد خلايا HEK293 ، وطردها بالطرد المركزي ، وإعادة تعليق الحبيبات في مخزن التثقيب الكهربائي عند ما يقرب من خمسة ملايين خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ترميز الحمض النووي للبلازما ل GFP إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام لكل ملليلتر واخلطه بلطف.
ثم نقل تعليق خلية البلازما الحمض النووي إلى حقنة سنتيمتر مكعب واحد للتجريب. ضع الجهاز الصغير على مرحلة المجهر عبر حامل منزلق. ثم قم بتشغيل الجهاز المقترن المشحون ، وكاميرا CCD ، وقم بتركيز قناة الموائع الدقيقة.
بعد ذلك للتثقيب الكهربائي أحادي الخلية ، اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على 0.1 إلى 0.3 ميكرولتر في الدقيقة لضمان تدفق الخلايا المفردة عبر مجموعة القطب. ثم اضبط معلمات النبض لنبضة التثقيب الكهربائي الأولية والأدنى للطاقة الكهربائية. اتبع عددا محددا مسبقا من اكتشافات الخلايا لكل تطبيق نبض.
في نهاية كل حالة تم اختبارها ، قم بشفط الخلايا من منفذ الجهاز الصغير وقم بتجديد المخرج بوسائط الاسترداد. كرر إلى حالة نبض التثقيب الكهربائي التالية وكرر حتى يتم اختبار جميع ظروف نبض التثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، حدد معلمات نبض التثقيب الكهربائي للحصول على ردود فعل عالية الإنتاجية تستند إلى السكان.
بالنسبة للتثقيب الكهربائي الذي يتم التحكم فيه بالتغذية المرتدة على السكان ، اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على واحد إلى ثلاثة ميكرولتر في الدقيقة واضبط سعة النبضة على الحالة المثلى. ثم قم بإيقاف تشغيل وضع التشغيل واضبط عرض النبضة ليتناسب مع وقت عبور الخلية. بعد أن يتم شحن العدد المطلوب من الخلايا بالكهرباء ، قم بإيقاف تشغيل كل من مضخة المحاقن ومولد الوظيفة.
ثم انقل الخلايا من خزان المخرج إلى دورق أو صفيحة زراعة خلية بحجم مناسب مملوءة بوسائط استرداد دافئة مسبقا وانقل قارورة أو صفيحة الثقافة إلى حاضنة. لتحليل البيانات ، قم بتحميل البيانات في برنامج تحليل وإنشاء مخطط للتيار مقابل الوقت لكل حالة نابضة. ثم حدد درجة نفاذية غشاء الخلية ، وقم بإنشاء خريطة نفاذية غشاء الخلية على جميع ظروف النبض المختبرة ، وتحقق من حالة النبض المثلى.
بعد الحضانة ، التقط صورا مضان باستخدام FITC والمرشحات الحمراء البعيدة ، وقم بتحليل مجموعات الصور يدويا أو عبر خوارزمية. يتم تسليط الضوء هنا على مبادئ التشغيل وراء اكتشاف نفاذية مستوى الخلية المفردة لسعة نبضة واحدة. بعد كل معلمة نبضة التثقيب الكهربائي ، يتم اختبار نبضة التثقيب الكهربائي التالية الأعلى طاقة.
أظهرت خريطة نفاذية غشاء الخلية لخلايا HEK293 ارتباطا واضحا بين الطاقة الكهربائية المطبقة ودرجة نفاذية غشاء الخلية. في هذه التجربة ، تم تحديد شدة المجال الكهربائي البالغة 1.8 كيلو فولت لكل سنتيمتر ونبضة 670 ميكروثانية على أنها الأمثل. عند هذه القيم ، تم تحقيق كفاءة نقل كهربائي بنسبة 70٪.
على النقيض من شدة المجال الكهربائي البالغة 0.4 كيلو فولت لكل سنتيمتر ومدة نبضة ثلاثة مللي ثانية ، كانت كفاءة النقل الكهربائي في 24 ساعة أقل من 5٪ مصطلح الوصفة ، والذي يستخدم غالبا عند وصف محدد لعملية التصنيع الدقيقة ، أدخل أهمية اتباع أو تحسين كل خطوة لتصنيع جهاز فعال بنجاح. يمكن استخدام تقنية التثقيب الكهربائي هذه في مشاريع بحثية طبية حيوية إضافية مثل توليد واختبار الخلايا التائية CAR T أو تحسين واختبار تقنيات تحرير الجينات CRISPR-Cas9. تسمح تقنية التثقيب الكهربائي الدقيق هذه بالاستجواب الكهربائي لاستجابات أنواع الخلايا المختلفة لتطبيق ظروف النبض الكهربائي وربط تلك المعلومات بتسليم البضائع الجزيئية ذات الصلة سريريا.
