이 방법을 통해 연구원은 원하는 세포 유형에 대한 최적의 전기 천공 펄스 조건을 결정하는 동시에 기존의 경험적 실험 접근 방식의 필요성을 최소화 할 수 있습니다. 이 방법은 마이크로 전기 천공 기술을 활용하여 전기 천공 공정 전반에 걸쳐 세포막 투과 정도를 전기적으로 모니터링 할 수있는 확장 가능한 미세 유체 작동 장치를 제조합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 석사 과정 학생 인 Kishankumar Busha가 될 것입니다.
시작하려면 스핀 코터의 진공 시스템을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 웨이퍼 스핀 코터의 척에 고정합니다. 그런 다음 스피너를 프로그래밍하십시오. 다음으로 4 밀리리터의 SU-8 2010 포토 레지스트를 실리콘 웨이퍼의 중앙에 분배하고 프로그램을 실행하십시오.
시스템이 정지되면 진공 청소기를 끕니다. 그런 다음 2D 미세 유체 채널 디자인의 포토 마스크를 마스크 홀더에 고정하고 SU-8 코팅이 위쪽을 향하도록 실리콘 웨이퍼를 웨이퍼 척에 삽입합니다. 노출 설정을 평방 센티미터당 150밀리줄로 지정하고 기기를 실행합니다.
UV 노출 후 실리콘 웨이퍼를 SU-8 현상액 용액에 3-4분 동안 부드럽게 교반하면서 담그십시오. 그런 다음 용액에서 웨이퍼를 제거하고 이소프로판올로 표면을 헹굽니다. 다음으로 실리콘 웨이퍼를 섭씨 150도 오븐에 30분 동안 넣어 하드 베이킹합니다.
그런 다음 스타일러스 프로파일 로메트리를 사용하여 채널 측벽의 정확한 높이와 기울기를 측정하기 전에 실온으로 식히십시오. 그런 다음 1 밀리리터의 포토 레지스트를 유리 슬라이드 표면에 분배하고 프로그램을 다시 한 번 실행하십시오. 시스템이 정지되면 진공 청소기를 끄고 유리 슬라이드를 제거합니다.
2D 전극 디자인의 포토 마스크를 마스크 홀더에 고정한 후 S-1818 코팅이 위쪽을 향하도록 유리 웨이퍼를 웨이퍼 척에 삽입하고 정렬합니다. 노출 설정을 제곱센티미터당 215밀리줄로 지정하고 기기를 실행합니다. 노출 후, 유리 슬라이드를 MF-319 현상액 내에 2분 동안 침지시키고, 부드러운 교반을 가한다.
그런 다음 유리 웨이퍼를 제거하고 탈 이온수로 표면을 헹굽니다. 마지막으로 유리 슬라이드를 섭씨 150도 오븐에 넣어 하드 베이킹하여 관심 있는 기판 표면이 위를 향하도록 합니다. 30 분 후 오븐에서 슬라이드를 꺼내 빛으로부터 보호하십시오.
에칭 유리 슬라이드를 10 내지 1의 완충된 불산 용액에 1분 동안 폴리테트라플루오로에틸렌 용기에 담그었다. 그런 다음 유리 슬라이드를 탈 이온수로 3 번 옮기고 씻으십시오. 다음으로, 물리적 증착 시스템을 사용하여 분당 100 옹스트롬의 속도로 8분 동안 티타늄을 스퍼터링하고 분당 200 옹스트롬에서 10분 동안 백금을 첨가한다.
그런 다음 포토 레지스트를 들어 올리려면 금속 코팅 유리 슬라이드를 아세톤 욕조에 10 분 동안 담그고 욕조를 초음파 처리하여 교반을 도입합니다. 필요한 경우 아세톤에 적신 물티슈를 사용하여 잔여물을 제거하십시오. 다음으로 폴리디메틸실록산 복제 성형을 위해 경화제를 사용하여 PDMS 엘라스토머 베이스를 전자 저울 위에 놓인 일회용 용기에 10:1 중량비로 만든다.
그런 다음 PDMS 용액을 실리콘 웨이퍼 위에 붓고 혼합물을 진공 하에 두어 기포를 제거합니다. 혼합물을 섭씨 65도에서 최소 4시간 동안 경화시킨 후 면도날 끝을 사용하여 성형된 PDMS를 잘라내어 실리콘 웨이퍼에서 벗겨냅니다. 그런 다음 날카로운 생검 펀치를 사용하여 장치의 입구와 출구에서 PDMS를 제거합니다.
다음으로, PDMS 접합을 위한 플라즈마 발생기를 프로그래밍한다. 그런 다음 PDMS 및 전극 유리 슬라이드를 피쳐가 위를 향하도록 시스템에 놓고 프로그램을 실행합니다. 프로그램이 완료되면 장치를 제거하고 스테레오스코프를 사용하여 채널 기능을 전극에 빠르게 정렬합니다.
PDMS 중앙에서 측면으로 압력을 가하여 본딩 인터페이스에서 원치 않는 기포를 제거합니다. HEK293 세포를 수확하고 원심분리한 다음 펠릿을 밀리리터당 약 500만 세포씩 전기천공 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, GFP에 대해 코딩하는 혈장 DNA를 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도로 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
그런 다음 실험을 위해 혈장 -DNA 세포 현탁액을 1 입방 센티미터 주사기로 옮깁니다. 슬라이드 홀더를 통해 현미경 스테이지에 마이크로 장치를 놓습니다. 그런 다음 충전 된 결합 장치 인 CCD 카메라를 켜고 미세 유체 채널에 초점을 맞 춥니 다.
다음으로 단일 셀 전기 천공의 경우 주사기 펌프 유량을 분당 0.1-0.3 마이크로 리터로 설정하여 전극 세트를 통한 단일 셀의 흐름을 보장합니다. 그런 다음 초기 및 최저 전기 에너지 전기 천공 펄스에 대한 펄스 매개 변수를 설정합니다. 펄스 애플리케이션당 미리 결정된 수의 세포 검출을 따르십시오.
테스트된 각 조건이 끝나면 마이크로 장치 배출구에서 세포를 흡입하고 배출구에 복구 매체를 보충합니다. 다음 전기천공 펄스 조건으로 반복하고 모든 전기천공 펄스 조건이 테스트될 때까지 반복합니다. 그런 다음 높은 처리량 모집단 기반 피드백에 대한 전기천공 펄스 파라미터를 결정합니다.
인구 기반 피드백 제어 전기 천공의 경우 주사기 펌프 유량을 분당 1-3 마이크로 리터로 설정하고 펄스 진폭을 최적화 된 조건으로 설정하십시오. 그런 다음 트리거 모드를 끄고 셀 이동 시간과 일치하도록 펄스 폭을 설정합니다. 원하는 수의 셀이 전기천공된 후 주사기 펌프와 함수 발생기를 모두 끕니다.
그런 다음 출구 저장소에서 사전 예열된 회수 배지로 채워진 적절한 크기의 세포 배양 플라스크 또는 플레이트로 세포를 옮기고 배양 플라스크 또는 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 데이터 분석의 경우 데이터를 분석 소프트웨어로 로드하고 각 펄스 조건에 대한 전류 대 시간 플롯을 생성합니다. 그런 다음 세포막 투과 정도를 결정하고 테스트된 모든 펄스 조건에 대해 세포막 투과 맵을 생성하고 최적의 맥동 조건을 확인합니다.
배양 후 FITC 및 원적색 필터를 사용하여 에피 형광 이미지를 캡처하고 수동으로 또는 알고리즘을 통해 이미지 세트를 분석합니다. 단일 펄스 진폭에 대한 단일 셀 레벨 투과화 감지의 작동 원리가 여기에 강조되어 있습니다. 각 전기 천공 펄스 매개 변수 후, 다음으로 가장 높은 에너지 전기 천공 펄스가 테스트됩니다.
HEK293 세포에 대한 세포막 투과화 맵은 적용된 전기 에너지와 세포막 투과 정도 사이에 뚜렷한 상관 관계를 보여주었습니다. 이 실험에서는 센티미터 당 1.8 킬로 볼트의 전계 강도와 670 마이크로 초 펄스가 최적으로 결정되었습니다. 이들 값에서, 70%의 전기-형질주입 효율이 달성되었다.
센티미터 당 0.4 킬로 볼트의 전기장 강도와 3 밀리 초 펄스 지속 시간과 대조적으로, 24 시간에서의 전기 트랜스 펙션 효율은 5 % 미만이었다마이크로 제조 공정의 특성을 설명 할 때 자주 사용되는 레시피라는 용어는 기능 장치를 성공적으로 제조하기 위해 각 단계를 따르거나 최적화하는 것의 중요성을 삽입합니다. 이 전기 천공 기술은 CAR T 세포의 생성 및 테스트 또는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술의 최적화 및 테스트와 같은 추가 생물 의학 연구 프로젝트에 활용 될 수 있습니다. 이 마이크로 전기천공 기술을 사용하면 다양한 세포 유형의 반응을 전기적으로 조사하여 전기 펄스 조건을 적용하고 해당 정보를 임상적으로 관련된 분자 화물의 전달과 연관시킬 수 있습니다.
