Este método permite aos pesquisadores determinar as condições ideais de pulsação de eletroporação para o tipo de célula desejada, minimizando a necessidade da abordagem experimental empírica tradicional. Este método utiliza técnicas de micro-eletroporação para fabricar um dispositivo de atuação microfluídica escalável que é capaz de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular durante todo o processo de eletroporação. Demonstrando o procedimento estará Kishankumar Busha, um estudante de mestrado do meu laboratório.
Para começar, prenda a bolacha de silício ao mandril do revestidor de fiação de bolacha usando o sistema de vácuo do revestidor de fiação. Em seguida, programe o spinner. Em seguida, dispense quatro mililitros de SU-8 2010 foto resistir no centro da bolacha de silício e executar o programa.
Quando o sistema parar, desligue o vácuo. Em seguida, prenda a máscara fotográfica com os desenhos de canal microfluídico 2D no suporte da máscara e insira a bolacha de silício com o revestimento SU-8 voltado para cima no mandril da bolacha. Defina as configurações de exposição para 150 milijoules por centímetro quadrado e execute a máquina.
Após a exposição aos raios UV, submerja a bolacha de silício na solução reveladora SU-8 com agitação suave por três a quatro minutos. Em seguida, retire a bolacha da solução e lave a superfície com isopropanol. Em seguida, coloque a bolacha de silício em um forno de 150 graus Celsius por 30 minutos para um cozimento duro.
Em seguida, permita que ele esfrie até a temperatura ambiente antes de usar a perfilometria da caneta para medir a altura e a inclinação exatas das paredes laterais do canal. Em seguida, dispense um mililitro de resistência fotográfica na superfície da lâmina de vidro e execute o programa mais uma vez. Quando o sistema parar, desligue o vácuo e remova a lâmina de vidro.
Depois de fixar a máscara fotográfica com os desenhos de eletrodo 2D no suporte da máscara, insira e alinhe a bolacha de vidro com o revestimento S-1818 voltado para cima no mandril da bolacha. Defina as configurações de exposição para 215 milijoules por centímetro quadrado e execute a máquina. Após a exposição, submergiu a lâmina de vidro na solução reveladora MF-319 por dois minutos, aplicando agitação suave.
Em seguida, retire a bolacha de vidro e lave sua superfície com água deionizada. Finalmente, coloque a lâmina de vidro no forno de 150 graus Celsius para um cozimento duro, garantindo que a superfície de interesse dos substratos esteja voltada para cima. Após 30 minutos, retire a lâmina do forno e proteja-a da luz.
Para gravar a lâmina de vidro, submerja-a em uma solução de ácido fluorídrico tamponada 10 a 1 por um minuto em um recipiente de politetrafluoroetileno. Em seguida, transfira e lave as lâminas de vidro em água deionizada três vezes. Em seguida, usando um sistema físico de deposição de vapor esguicho titânio por oito minutos a uma taxa de 100 angstroms por minuto e platina por 10 minutos a 200 angstroms por minuto.
Em seguida, para levantar a resistência à foto, submerja as lâminas de vidro revestidas de metal em um banho de acetona por 10 minutos e sonicate o banho para introduzir agitação. Se necessário, use um lenço embebido em acetona para remover quaisquer resíduos. Em seguida, para a moldagem de réplicas de polidimetilsiloxano, a base de elastômero PDMS é feita com um endurecedor na proporção de peso de 10 para 1 em um recipiente descartável colocado em cima de uma balança eletrônica.
Em seguida, despeje a solução PDMS sobre a bolacha de silício e coloque a mistura sob vácuo para remover as bolhas de ar. Depois de curar a mistura a 65 graus Celsius por um mínimo de quatro horas, use a ponta de uma lâmina de barbear para cortar o PDMS moldado e descascá-lo da bolacha de silício. Em seguida, usando um soco de biópsia afiado, remova o PDMS da entrada e das saídas do dispositivo.
Em seguida, programe o gerador de plasma para ligação PDMS. Em seguida, coloque o PDMS e o deslizamento de vidro do eletrodo no sistema com os recursos voltados para cima e execute o programa. Após a conclusão do programa, remova os dispositivos e use um estereoscópio para alinhar rapidamente os recursos do canal aos eletrodos.
Aplique firmemente pressão do centro do PDMS em direção aos lados para remover quaisquer bolhas de ar indesejadas na interface de ligação. Colha as células HEK293, centrifuga-as e ressuspenda o pellet em tampão de eletroporação a aproximadamente cinco milhões de células por mililitro. Em seguida, adicione a codificação de DNA plasmático para GFP a uma concentração final de 20 microgramas por mililitro e misture suavemente.
Em seguida, transfira a suspensão de células plasmáticas de DNA para uma seringa cúbica de centímetros para experimentação. Coloque o microdispositivo no palco do microscópio através de um suporte de lâmina. Em seguida, ligue o dispositivo acoplado carregado, a câmera CCD e coloque o canal microfluídico em foco.
Em seguida, para eletroporação de célula única, defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,1 a 0,3 microlitros por minuto para garantir o fluxo de células individuais através do conjunto de eletrodos. Em seguida, defina os parâmetros de pulso para o pulso de eletroporação de energia elétrica inicial e mais baixa. Siga um número predeterminado de detecções de células por aplicativo de pulso.
No final de cada condição testada, aspirar as células da saída do microdispositivo e reabastecer a saída com meios de recuperação. Itere para a próxima condição de pulso de eletroporação e repita até que todas as condições de pulso de eletroporação sejam testadas. Em seguida, determine os parâmetros de pulso de eletroporação para feedback de base populacional de alto rendimento.
Para eletroporação controlada por feedback de base populacional, defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para um a três microlitros por minuto e defina a amplitude de pulso para a condição otimizada. Em seguida, desative o modo de gatilho e defina a largura de pulso para corresponder ao tempo de trânsito da célula. Após o número desejado de células ter sido eletroporado, desligue a bomba da seringa e o gerador de funções.
Em seguida, transfira as células do reservatório de saída para um balão ou placa de cultura de células de tamanho adequado preenchido com meios de recuperação pré-aquecidos e transfira o balão ou a placa de cultura para uma incubadora. Para análise de dados, carregue os dados em um software de análise e gere um gráfico de corrente versus tempo para cada condição pulsante. Em seguida, determine o grau de permeabilização da membrana celular, gere o mapa de permeabilização da membrana celular em todas as condições de pulso testadas e verifique a condição de pulsação ideal.
Após a incubação, capture imagens de epifluorescência usando filtros FITC e vermelhos distantes e analise os conjuntos de imagens manualmente ou por meio de um algoritmo. Os princípios operacionais por trás da detecção de permeabilização em nível de célula única para uma única amplitude de pulso são destacados aqui. Após cada parâmetro de pulso de eletroporação, o próximo pulso de eletroporação de maior energia é testado.
O mapa de permeabilização da membrana celular para as células HEK293 mostrou uma correlação distinta entre a energia elétrica aplicada e o grau de permeabilização da membrana celular. Neste experimento, uma força de campo elétrico de 1,8 quilovolts por centímetro e um pulso de 670 microssegundos foi determinada como ótima. Nesses valores, obteve-se uma eficiência de eletrotransfecção de 70%.
Em contraste com uma força de campo elétrico de 0,4 quilovolts por centímetro e uma duração de pulso de três milissegundos, a eficiência de eletrotransfecção em 24 horas foi inferior a 5%O termo receita, que é frequentemente usado ao descrever o específico do processo de microfabricação, insere a importância de seguir ou otimizar cada passo para fabricar com sucesso um dispositivo funcional. Esta tecnologia de eletroporação pode ser utilizada em projetos de pesquisa biomédica adicionais, como a geração e teste de células T CAR ou a otimização e teste de técnicas de edição de genes CRISPR-Cas9. Esta tecnologia de micro-eletroporação permite o interrogatório elétrico das respostas de diferentes tipos de células para aplicar as condições de pulsação elétrica e correlacionar essa informação com a entrega de carga molecular clinicamente relevante.
