Этот метод позволяет исследователям определить оптимальные условия пульсации электропорации для желаемого типа клеток, сводя к минимуму необходимость традиционного эмпирического экспериментального подхода. Этот метод использует методы микроэлектропорации для изготовления масштабируемого микрофлюидного исполнительного устройства, которое способно электрически контролировать степень проницаемости клеточной мембраны на протяжении всего процесса электропорации. Демонстрировать процедуру будет Кишанкумар Буша, студент магистратуры из моей лаборатории.
Для начала закрепите кремниевую пластину на патроне вафельного спин-коатера с помощью вакуумной системы спин-коатера. Затем запрограммируйте спиннер. Далее дозируйте четыре миллилитра фотореспондента СУ-8 2010 года на центр кремниевой пластины и запустите программу.
Как только система остановится, выключите вакуум. Затем закрепите фотомаску с помощью 2D-микрофлюидных каналов на держателе маски и вставьте кремниевую пластину с покрытием SU-8, обращенную вверх, на вафельный патрон. Установите настройки экспозиции на 150 миллиджоулей на квадратный сантиметр и запустите машину.
После воздействия ультрафиолета погрузите кремниевую пластину в раствор для разработчиков SU-8 с мягким перемешиванием на три-четыре минуты. Затем извлеките пластину из раствора и промойте поверхность изопропанолом. Затем поместите кремниевую в духовку при температуре 150 градусов Цельсия на 30 минут для жесткой выпечки.
Затем дайте ему остыть до комнатной температуры перед использованием профилометрии стилуса для измерения точной высоты и наклона боковых стенок канала. Затем нанесите один миллилитр фоторезистента на поверхность стеклянного слайда и запустите программу еще раз. Как только система остановится, выключите вакуум и удалите стекло.
После закрепления фотомаски с помощью 2D-электродов на держателе маски вставьте и выровняйте стеклянную пластину с покрытием S-1818, обращенным вверх на вафельный патрон. Установите настройки экспозиции для 215 миллиджоулей на квадратный сантиметр и запустите машину. После экспозиции погружают стеклянную горку в раствор разработчика MF-319 на две минуты, применяя мягкое перемешивание.
Затем снимите стеклянную пластину и промойте ее поверхность деионизированной водой. Наконец, поместите стеклянную горку в печь со скоростью 150 градусов Цельсия для твердой выпечки, гарантируя, что интересующая поверхность подложек обращена вверх. Через 30 минут достаньте горку из духовки и защитите ее от света.
Чтобы вытравить стеклянный слайд, погрузите его в буферный раствор плавиковой кислоты 10 к 1 на одну минуту в контейнер для политетрафторэтилена. Затем трижды переложите и вымойте стеклянные горки в деионизированной воде. Далее, используя физическую систему осаждения из пара, распыляйте титан в течение восьми минут со скоростью 100 ангстрем в минуту и платину в течение 10 минут при 200 ангстремах в минуту.
Затем, чтобы снять фоторезистим, погрузите стеклянные горки с металлическим покрытием в ацетоновую ванну на 10 минут и обработайте ванну ультразвуком, чтобы ввести перемешивание. При необходимости используйте пропитанную ацетоном салфетку для удаления остатков. Далее для полидиметилсилоксановой реплики формования делается эластомерное основание PDMS с отвердителем в весовом соотношении 10 к 1 в одноразовом контейнере, размещенном поверх электронных весов.
Затем налейте раствор PDMS на кремниевую пластину и поместите смесь под вакуум, чтобы удалить пузырьки воздуха. После отверждения смеси при 65 градусах Цельсия в течение как минимум четырех часов используйте кончик лезвия бритвы, чтобы вырезать формованную PDMS и очистить ее от кремниевой пластины. Затем, используя заточенный биопсийный перфоратор, удалите PDMS из входного и выходного отверстий устройства.
Затем запрограммируйте плазменный генератор для склеивания PDMS. Затем поместите PDMS и электродное стекло в систему с функциями, обращенными вверх, и запустите программу. После завершения программы извлеките устройства и используйте стереоскоп для быстрого выравнивания характеристик канала с электродами.
Плотно приложите давление от центра PDMS к бокам, чтобы удалить нежелательные пузырьки воздуха на интерфейсе склеивания. Соберите ячейки HEK293, центрифугируйте их и повторно суспендируйте гранулу в электропорационном буфере примерно на пять миллионов ячеек на миллилитр. Затем добавляют плазменную ДНК, кодирующую GFP, до конечной концентрации 20 мкг на миллилитр и аккуратно перемешивают.
Затем перенесите суспензию плазмо-ДНК-клетки в шприц на один кубический сантиметр для экспериментов. Поместите микроустройство на сцену микроскопа с помощью держателя слайдов. Затем включите заряженное устройство, ПЗС-камеру, и сфокусируйте микрофлюидный канал.
Затем для электропорации с одной ячейкой установите скорость потока шприцевого насоса на уровне от 0,1 до 0,3 микролитров в минуту, чтобы обеспечить поток одиночных ячеек через электродный набор. Затем задают параметры импульса для начального и наименьшего электропорационного импульса электрической энергии. Следите за заданным количеством обнаружений клеток для каждого импульсного приложения.
В конце каждого испытуемого состояния аспирируют клетки из выхода микроустройства и пополняют выход восстановительными средами. Повторите следующее состояние электропорационного импульса и повторяйте до тех пор, пока не будут проверены все условия электропорационного импульса. Затем определите параметры электропорационного импульса для высокой пропускной способности популяционной обратной связи.
Для электропорации с обратной связью на основе населения установите скорость потока шприцевого насоса на уровне от одного до трех микролитров в минуту и установите амплитуду импульса в оптимизированное состояние. Затем выключите режим триггера и установите ширину импульса в соответствии со временем прохождения ячейки. После того, как нужное количество ячеек было электропорировано, выключите как шприцевой насос, так и генератор функций.
Затем переместите клетки из выходного резервуара в колбу или пластину для культивирования клеток соответствующего размера, заполненную предварительно нагретой восстановительной средой, и перенесите колбу или пластину культуры в инкубатор. Для анализа данных загрузите данные в аналитическое программное обеспечение и сгенерируйте график текущего времени для каждого пульсирующего состояния. Затем определяют степень пермеабилизации клеточной мембраны, генерируют карту пермеабилизации клеточной мембраны по всем тестируемым условиям импульса и проверяют оптимальное пульсирующее состояние.
После инкубации захватывайте эпифлуоресцентные изображения с помощью FITC и дальних красных фильтров и анализируйте наборы изображений вручную или с помощью алгоритма. Здесь выделены принципы работы, лежащие в основе определения пермеабилизации на уровне одной ячейки для одной амплитуды импульса. После каждого параметра электропорационного импульса проверяется следующий по величине импульс электропорации.
Карта пермеабилизации клеточной мембраны для клеток HEK293 показала отчетливую корреляцию между применяемой электрической энергией и степенью пермеабилизации клеточной мембраны. В этом эксперименте напряженность электрического поля 1,8 киловольт на сантиметр и импульс 670 микросекунд были определены как оптимальные. При этих значениях была достигнута эффективность электротрансфекции 70%.
В отличие от напряженности электрического поля 0,4 киловольт на сантиметр и длительности импульса в три миллисекунды, эффективность электротрансфекции в течение 24 часов составляла менее 5% Термин рецепт, который часто используется при описании специфики процесса микропроизводства, вставляет важность следования или оптимизации каждого этапа для успешного изготовления функционирующего устройства. Эта технология электропорации может быть использована в дополнительных биомедицинских исследовательских проектах, таких как генерация и тестирование Т-клеток CAR или оптимизация и тестирование методов редактирования генов CRISPR-Cas9. Эта технология микроэлектропорации позволяет проводить электрический опрос ответов различных типов клеток для применения электрических пульсирующих условий и корреляции этой информации с доставкой клинически значимого молекулярного груза.
