Bu yöntem, araştırmacıların istenen hücre tipi için optimal elektroporasyon titreşim koşullarını belirlemelerini sağlarken, geleneksel ampirik deneysel yaklaşıma olan ihtiyacı en aza indirir. Bu yöntem, elektroporasyon işlemi boyunca hücre zarı geçirgenliğinin derecesini elektriksel olarak izleyebilen ölçeklenebilir bir mikroakışkan çalıştırma cihazı üretmek için mikro-elektroporasyon tekniklerini kullanır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Kishankumar Busha olacak.
Başlamak için, silikon gofreti, spin kaplayıcının vakum sistemini kullanarak gofret spin kaplayıcının mancasına sabitleyin. Ardından iplikçiyi programlayın. Daha sonra, silikon gofretin merkezine dört mililitre SU-8 2010 fotoğraf direnci dağıtın ve programı çalıştırın.
Sistem durduğunda, vakumu kapatın. Ardından, 2D mikroakışkan kanal tasarımlarıyla fotoğraf maskesini maske tutucuya sabitleyin ve SU-8 kaplamalı silikon gofreti gofret mandren üzerine yerleştirin. Santimetre kare başına 150 milijul pozlama ayarlarını yapın ve makineyi çalıştırın.
UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra, silikon gofreti SU-8 geliştirici çözümüne üç ila dört dakika boyunca nazik bir ajitasyonla batırın. Daha sonra gofreti çözeltiden çıkarın ve yüzeyi izopropanol ile durulayın. Daha sonra, silikon gofreti sert bir pişirme için 30 dakika boyunca 150 santigrat derece fırına yerleştirin.
Ardından, kanal yan duvarlarının tam yüksekliğini ve eğimini ölçmek için kalem profilometrisini kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ardından, cam slaytın yüzeyine bir mililitre fotoğraf direnci dağıtın ve programı bir kez daha çalıştırın. Sistem durduğunda, vakumu kapatın ve cam slaytı çıkarın.
Fotoğraf maskesini 2D elektrot tasarımlarıyla maske tutucusuna sabitledikten sonra, cam gofreti S-1818 kaplama ile gofret mandren üzerine yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve hizalayın. Santimetre kare başına 215 milijul pozlama ayarlarını yapın ve makineyi çalıştırın. Pozlamadan sonra, cam slaytı MF-319 geliştirici çözümüne iki dakika batırarak nazik ajitasyon uygulayın.
Ardından cam gofreti çıkarın ve yüzeyini deiyonize suyla durulayın. Son olarak, cam sürgüyü sert bir pişirme için 150 santigrat derece fırına yerleştirin ve ilgilenilen substrat yüzeyinin yukarı bakmasını sağlayın. 30 dakika sonra, sürgüyü fırından çıkarın ve ışıktan koruyun.
Cam sürgüyü kazımak için, bir politetrafloroetilen kapta bir dakika boyunca 10 ila 1 tamponlu hidroflorik asit çözeltisine batırın. Daha sonra cam slaytları deiyonize suda üç kez aktarın ve yıkayın. Daha sonra, fiziksel bir buhar biriktirme sistemi kullanarak, dakikada 100 angstrom hızında sekiz dakika boyunca titanyum ve dakikada 200 angstromda 10 dakika boyunca platin püskürtün.
Daha sonra fotoğraf direncini kaldırmak için, metal kaplı cam slaytları 10 dakika boyunca bir aseton banyosuna batırın ve ajitasyon sağlamak için banyoyu sonikleştirin. Gerekirse, kalıntıları gidermek için asetonla ıslatılmış bir mendil kullanın. Polidimetilsiloksan replika kalıplama için daha sonra, PDMS elastomer tabanını, elektronik terazinin üzerine yerleştirilmiş tek kullanımlık bir kapta 10 ila 1 ağırlık oranında bir sertleştirici ile yapar.
Ardından, PDMS çözeltisini silikon gofret üzerine dökün ve hava kabarcıklarını gidermek için karışımı bir vakum altına yerleştirin. Karışımı en az dört saat boyunca 65 santigrat derecede kürledikten sonra, kalıplanmış PDMS'yi kesmek ve silikon gofretten soymak için bir tıraş bıçağının ucunu kullanın. Daha sonra keskinleştirilmiş bir biyopsi punch kullanarak, PDMS'yi cihazın giriş ve çıkışlarından çıkarın.
Ardından, PDMS bağlama için plazma jeneratörünü programlayın. Ardından PDMS ve elektrot camı slaytını, özellikleri yukarı bakacak şekilde sisteme yerleştirin ve programı çalıştırın. Program tamamlandıktan sonra, cihazları çıkarın ve kanal özelliklerini elektrotlara hızlı bir şekilde hizalamak için bir stereoskop kullanın.
Yapıştırma arayüzündeki istenmeyen hava kabarcıklarını gidermek için PDMS'nin merkezinden yanlara doğru basıncı sıkıca uygulayın. HEK293 hücrelerini toplayın, santrifüj edin ve peleti elektroporasyon tamponunda mililitre başına yaklaşık beş milyon hücrede yeniden askıya alın. Daha sonra, GFP için plazma DNA kodlamasını mililitre başına 20 mikrogramlık son bir konsantrasyona ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Daha sonra plazma-DNA hücresi süspansiyonunu deney için bir santimetreküp şırıngaya aktarın. Mikrocihazı bir slayt tutucu aracılığıyla mikroskop sahnesine yerleştirin. Ardından şarjlı bağlı cihazı, CCD kamerayı açın ve mikroakışkan kanalı netlemeye getirin.
Tek hücreli elektroporasyon için, tek hücrelerin elektrot setinden akışını sağlamak için şırınga pompası akış hızını dakikada 0,1 ila 0,3 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, ilk ve en düşük elektrik enerjisi elektroporasyon darbesi için darbe parametrelerini ayarlayın. Darbe uygulaması başına önceden belirlenmiş sayıda hücre algılamasını izleyin.
Test edilen her durumun sonunda, hücreleri mikrocihaz çıkışından aspire edin ve çıkışı geri kazanım medyasıyla doldurun. Bir sonraki elektroporasyon darbe koşuluna tekrarlayın ve tüm elektroporasyon darbe koşulları test edilene kadar tekrarlayın. Ardından, yüksek verimli popülasyon tabanlı geri bildirim için elektroporasyon darbe parametrelerini belirleyin.
Popülasyon tabanlı geri besleme kontrollü elektroporasyon için, şırınga pompası akış hızını dakikada bir ila üç mikrolitreye ayarlayın ve nabız genliğini optimize edilmiş duruma ayarlayın. Ardından tetikleme modunu kapatın ve darbe genişliğini hücre geçiş süresiyle eşleşecek şekilde ayarlayın. İstenilen sayıda hücre elektroporasyondan sonra hem şırınga pompasını hem de fonksiyon jeneratörünü kapatın.
Daha sonra hücreleri çıkış rezervuarından uygun boyutta bir hücre kültürü şişesine veya önceden ısıtılmış geri kazanım ortamıyla doldurulmuş bir plakaya aktarın ve kültür şişesini veya plakasını bir inkübatöre aktarın. Veri analizi için, verileri bir analiz yazılımına yükleyin ve her darbeli koşul için akıma karşı zamanın bir grafiğini oluşturun. Daha sonra hücre zarı geçirgenliğinin derecesini belirleyin, test edilen tüm darbe koşullarında hücre zarı geçirgenlik haritasını oluşturun ve optimum darbe durumunu doğrulayın.
Kuluçkadan sonra, FITC ve uzak kırmızı filtreleri kullanarak epi-floresan görüntüleri yakalayın ve görüntü kümelerini manuel olarak veya bir algoritma aracılığıyla analiz edin. Tek bir darbe genliği için tek hücre seviyesi geçirgenlik algılamasının arkasındaki çalışma prensipleri burada vurgulanmaktadır. Her elektroporasyon darbe parametresinden sonra, bir sonraki en yüksek enerjili elektroporasyon darbesi test edilir.
HEK293 hücreleri için hücre zarı geçirgenlik haritası, uygulanan elektrik enerjisi ile hücre zarı geçirgenliğinin derecesi arasında belirgin bir korelasyon göstermiştir. Bu deneyde, santimetre başına 1.8 kilovoltluk bir elektrik alan kuvveti ve 670 mikrosaniyelik bir darbe optimal olarak belirlenmiştir. Bu değerlerde %70 elektro-transfeksiyon etkinliği elde edilmiştir.
Santimetre başına 0,4 kilovoltluk bir elektrik alan mukavemeti ve üç milisaniyelik bir darbe süresinin aksine, 24 saatte elektro-transfeksiyon verimliliği% 5'ten azdıMikro üretim sürecinin özgüllüğünü tanımlarken sıklıkla kullanılan tarif terimi, işleyen bir cihazı başarılı bir şekilde üretmek için her adımı takip etmenin veya optimize etmenin önemini ekler. Bu elektroporasyon teknolojisi, CAR T hücrelerinin üretimi ve test edilmesi veya CRISPR-Cas9 gen düzenleme tekniklerinin optimizasyonu ve test edilmesi gibi ek biyomedikal araştırma projelerinde kullanılabilir. Bu mikro-elektroporasyon teknolojisi, elektriksel darbe koşullarını uygulamak ve bu bilgiyi klinik olarak ilgili moleküler kargonun teslimi ile ilişkilendirmek için farklı hücre tiplerinin tepkilerinin elektriksel olarak sorgulanmasına izin verir.
