يصف هذا البروتوكول سلسلة من التقنيات ضمن سير عمل مستمر يمكن استخدامها لتقييم الآثار في الجسم الحي للمنظمين المرشحين لورم خبيث سرطان الجلد ، ولكن أيضا من ورم خبيث من الأورام الخبيثة الصلبة الأخرى. الميزة الرئيسية لسير العمل المنهجي لدينا هي زيادة قابلية تكرار البيانات بسبب نماذج وتقنيات قوية وموحدة في الجسم الحي. يوفر خط الأنابيب هذا مسارا لاكتشاف الأهداف وتطوير العلاج من خلال اختبار المرشحين المستنبطين من بيانات Omics أو الفحوصات المختبرية في بيئة في الجسم الحي.
يتم تقصير منحنى التعلم المرتبط بالتقنيات المقدمة في هذا البروتوكول باستخدام المواد المقدمة واتباع الوصف التفصيلي عند ممارسة الخطوات. سيساعد في إثبات الإجراء أورلاندو أريستيزابال ، عالم أبحاث في The Preclinical Imaging Core وران مبارك ، وهو مدرب في مختبري. بالنسبة للحقن داخل الأدمة، قم بتخدير وحلق ماوس عمره من ثمانية إلى 10 أسابيع داخل خزانة السلامة البيولوجية مع الحفاظ على ظروف معقمة.
ثم أمسك الجلد وسحبه إلى الخلف ضد مسار طعنة الإبرة وباستخدام إبرة حقنة الأنسولين بطول ستة ملليمترات وقياس 31 ، قم بثقب الجلد بلطف بزاوية حادة مع توجيه الشطب لأعلى. حقن 30 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية ببطء ، حتى يتم ملاحظة عجلة على شكل قبة. مراقبة تطور نمو الورم وفقدان الوزن والحالة الصحية العامة.
خلال جلسات المراقبة هذه ، خذ القياسات باستخدام الفرجار واستخدم أبعاد الطول والعرض للورم لحساب الحجم. بالنسبة للحقن داخل القلب ، انقل ماوس مخدر إلى المنصة الساخنة لجهاز الموجات فوق الصوتية. ثم باستخدام شريط هيبوالرجينيك ، قم بتأمين الماوس على مخروط الأنف.
حلق الصدر بشفرة حلاقة مستقيمة أو شفرة مشرط ، مائلة بزاوية 30 درجة وتنظيف الجلد حول منطقة الإجراء باستخدام 10٪ من يودات البوفيدون. بعد ذلك ، ضع مسبار الموجات فوق الصوتية في منتصف الصدر على الجانب الأيسر من الماوس لالتقاط نافذة أفقية موجهة للحصول على رؤية مقطعية مستعرضة للبطين الأيسر. مع توجيه المحور الطويل للمسبار لأعلى ، قم بإصلاح المسبار بزاوية 50 درجة والمنصة المسخنة بزاوية 20 درجة ، ثم قم بقفل المسبار وإطار الدعم في الموضع.
أثناء العمل داخل خزانة الأمان ، ارسم تعليق الخلية في حقنة السل بملليلتر واحد مع إبرة قياس 30 بوصة واحدة. قم بإزالة أي فقاعات هواء موجودة في المحقنة. قفل المحقنة في حاقن التجسيم.
ثم تحت توجيه الموجات فوق الصوتية ، تقدم الإبرة عبر جدار الصدر إلى البطين الأيسر للقلب وحقن 100 إلى 250 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية ببطء. بالنسبة لجراحة البقاء على قيد الحياة المرحلية ، ضع الماوس المخدر على وسادة الاحترار ونظف الجلد حول منطقة الإجراء بمحلول يود البوفيدون بنسبة 10٪. بعد ارتداء معدات الحماية الشخصية المعقمة والقفازات ، ضع ستارة معقمة على جسم الحيوان.
بعد ذلك ، باستخدام مقص القزحية أو مشرط ، قم بشق الجلد ، مع الحفاظ على هامش استئصال من خمسة إلى سبعة ملليمترات من حافة الورم. في حالة الأورام داخل الأدمة ، استئصل الورم مع الجلد المحيطي. بالنسبة للأورام تحت الجلد ، قم بتشريح الورم وإزالته تحت الجلد.
بعد استئصال الورم ، أغلق الجرح بجهاز تدبيس تسعة ملليمترات. بالنسبة للتصوير في الجسم الحي ، قم بإعطاء ركيزة d-luciferin للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة أنسولين بملليلتر واحد وإبرة قياس 28 ثم قم بتخدير الماوس ووضعه في مخروط الأنف داخل ماسح التصوير الحيوي للتلميع. ابدأ تشغيل الأداة بالضغط على تهيئة وتعيين وقت التعرض للضوء على تلقائي.
لالتقاط صورة فارغة لطرح الخلفية، انقر فوق الحصول على الصورة وحفظها بعد اكتمال تسلسل الاستحواذ. لتحليل البيانات ونفس الشيء في برنامج التصوير الحي ، انتقل إلى المجلد حيث يتم حفظ الصور وافتح صور جميع الفئران من تجربة واحدة. اضبط الوحدات على الإشعاع وتأكد من عدم تحديد خانة الاختيار التي تشير إلى الفرد لأن هذا سيحول دون تطبيع الإشارة عبر المجموعات.
بعد ذلك ، باستخدام منطقة الاهتمام أو أداة رسم عائد الاستثمار ، ارسم عائد استثمار دائري لمنطقة الدماغ وعائد استثمار مستطيل للجسم ، واستبعد الأذنين والأنف في عائد الاستثمار في الدماغ لأنها تميل إلى إصدار إضاءة غير محددة. لتقليل التحيز، ارسم عائد الاستثمار على صور الفئران دون وضع إشارة مضيئة بشكل زائد، ثم حدد قياس عائد الاستثمار لتحديد كمية الإشارة وتصدير البيانات إلى جدول بيانات. تحليل الاختلافات بين المجموعات عن طريق رسم التدفق الكلي للإضاءة في مناطق الجسم ذات الاهتمام.
بعد تلطيخ NuMA باستخدام البرنامج ، ارسم عائد استثمار ليشمل جميع الخلايا الملطخة NuMA داخل أنسجة العضو ، باستثناء حمة الأعضاء الأخرى والمساحات الفارغة. اضبط الإعدادات لتصنيف الخلايا الإيجابية NuMA والخلايا السلبية NuMA أثناء استخدام عناصر التحكم الإيجابية والسلبية المناسبة لكل عضو. استخدم خوارزمية برمجية ثابتة لتحديد العدد الإجمالي للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية NuMA لكل عينة.
يوضح التلألؤ الحيوي ، والحقل الساطع ، والتألق خارج الجسم الحي ، وصور تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين النهج متعدد الجوانب لتحليل تأثيرات الجينات المرشحة على ورم خبيث سرطان الجلد. فوكوزيل ترانسفيراز إسكات ضعف الانتشار النقيلي لخلايا سرطان الجلد. تظهر هنا أقسام الرئة الملطخة ب NuMA من خلايا سرطان الجلد المصابة بفيروس ليندا المسيطر عليه وبمثبط ورم خبيث يعبر عن فيروس ليندا.
يتم تصنيف خلايا سرطان الجلد النقيلي باللون الأخضر ويتم تحديد منطقة العضو بواسطة خط أخضر فقس. الحفاظ على التوتر المناسب في الجلد عند إجراء الحقن داخل الأدمة ، وتجنب انسداد الهواء عند إعداد المحاقن والحصول على هوامش استئصال كافية لا ينبغي أن تتداخل مع حركة الحيوان أو تهيئه لمضاعفات الجرح ، تساعد على تحسين معدل النجاح والتكاثر. إن المزيد من التوظيف للتصوير متعدد الإرسال لفحص الترشيح المناعي ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحليل التعبير الجيني والنسخ المكاني يمكن أن توفر جميعها سبلا مجانية لفحص عدم التجانس داخل الفخذ.
ساعدنا مزيج التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول على تحديد المنظمين الجدد في ورم خبيث دماغي للورم الميلانيني ، مثل دور بيتا أميلويد المفرزة في قمع الالتهاب العصبي وتعزيز ورم خبيث في الدماغ.
