פרוטוקול זה מתאר סדרה של טכניקות בתוך זרימת עבודה רציפה שניתן להשתמש בהן להערכת ההשפעות in vivo של מווסתים מועמדים של גרורות מלנומה, אך גם של גרורות של ממאירויות מוצקות אחרות. היתרון העיקרי של זרימת העבודה השיטתית שלנו הוא יכולת שכפול מוגברת של הנתונים עקב מודלים וטכניקות in vivo חזקים וסטנדרטיים. צינור זה מציע מסלול לגילוי מטרה ופיתוח טיפול על ידי בדיקת מועמדים המוסקים מנתוני Omics או ממבחני in vitro בסביבה in vivo.
עקומת הלמידה הקשורה לטכניקות המוצגות בפרוטוקול זה מתקצרת על ידי שימוש בחומרים שסופקו ומעקב אחר התיאור המפורט בעת תרגול השלבים. מי שיסייעו להדגים את ההליך יהיו אורלנדו אריסטיזבל, מדען מחקר בליבת ההדמיה הפרה-קלינית ורן מובארק, מדריך במעבדה שלי. להזרקות תוך-עוריות, יש להרדים ולגלח עכבר בן שמונה עד עשרה שבועות בתוך ארון בטיחות ביולוגית תוך שמירה על מצבים אספטיים.
לאחר מכן תפסו והחזירו את העור לאחור כנגד מסלול דקירה של המחט והשתמשו במחט מזרק אינסולין באורך שישה מילימטרים, 31 מדים, נקבו בעדינות את העור בזווית חריפה כאשר השיפוף פונה כלפי מעלה. הזריקו 30 מיקרוליטרים של מתלי תאי הגידול באיטיות, עד שנצפה גלגל בצורת כיפה. עקוב אחר התקדמות גידול הגידול, ירידה במשקל ומצב בריאותי כללי.
במהלך מפגשי ניטור אלה, קח מדידות עם קליפרים והשתמש בממדי האורך והרוחב של הגידול כדי לחשב את הנפח. עבור זריקות תוך לב, להעביר עכבר מורדם על הפלטפורמה המחוממת של מכשיר האולטרסאונד. לאחר מכן באמצעות סרט היפואלרגני, מהדק את העכבר לחרוט האף.
גילחו את בית החזה באמצעות סכין גילוח ישרה או להב אזמל, מוטה בזווית של 30 מעלות ונקו את העור סביב אזור ההליך עם יוד 10% פובידון. לאחר מכן, מקם את בדיקת האולטרסאונד באמצע בית החזה בצד שמאל של העכבר כדי ללכוד חלון אופקי המכוון כדי לקבל תצוגת חתך של החדר השמאלי. כאשר הציר הארוך של הגשושית פונה כלפי מעלה, קבעו את הגשושית בזווית של 50 מעלות ואת הפלטפורמה המחוממת בזווית של 20 מעלות, ואז נעלו את הגשושית ואת מסגרת התמיכה במצב.
תוך כדי עבודה בתוך ארון הבטיחות, ציירו את מתלי התא במזרק שחפת אחד מיליליטר עם מחט בגודל 30 אינץ' אחד. הסר את בועות האוויר הקיימות במזרק. נעל את המזרק במזרק הסטריאוטקטי.
ואז בהנחיית אולטרסאונד, מקדמים את המחט דרך דופן בית החזה לחדר השמאלי של הלב ומזריקים 100 עד 250 מיקרוליטרים של תרחיף תאי הגידול לאט. לניתוח הישרדות מבוים, הניחו את העכבר המרדים על כרית החימום ונקו את העור סביב אזור ההליך עם תמיסת יוד 10% povidone. לאחר שהתאמנו ציוד הגנה אישי סטרילי וכפפות, הניחו וילון סטרילי על גוף החיה.
לאחר מכן, באמצעות מספריים של איריס או אזמל, מכניסים את העור, ושומרים על מרווח כריתה של חמישה עד שבעה מילימטרים מקצה הגידול. במקרה של גידולים תוך עוריים, יש לכרות את הגידול יחד עם העור ההיקפי. עבור גידולים תת עוריים, לנתח ולהסיר את הגידול מתחת לעור.
לאחר כריתת הגידול, סגרו את הפצע באמצעות מכשיר הידוק של תשעה מילימטרים. להדמיית in vivo, תנו מצע d-לוציפרין לעכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית עם מזרק אינסולין מיליליטר אחד ומחט 28 מדים ואז הרימו את העכבר והכניסו אותו לתוך חרוט אף בתוך סורק ההדמיה הביו-לומינסנציה. הפעל את המכשיר על ידי לחיצה על אתחול והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי.
ללכידת תמונה ריקה לחיסור רקע, לחץ על רכוש ושמור את התמונה לאחר השלמת רצף הרכישה. לניתוח נתונים ואותה תוכנת הדמיה in vivo, נווטו לתיקייה שבה נשמרות התמונות ופתחו את התמונות של כל העכברים מניסוי אחד. הגדר את היחידות לזוהר וודא שתיבת הסימון המציינת אדם אינה מסומנת מכיוון שהדבר ימנע נורמליזציה של האות בין קבוצות.
לאחר מכן, באמצעות אזור העניין או כלי ציור החזר ההשקעה, ציירו ROI's מעגליים עבור אזור המוח ו- ROI מלבני עבור הגוף, לא כוללים את האוזניים והאף במוח ROI מכיוון שהם נוטים לפלוט זוהר לא ספציפי. כדי למזער את ההטיה, צייר ROI's על התמונות של העכברים ללא כיסוי האות הזוהר, ולאחר מכן בחר למדוד ROI's כדי לכמת את האות ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. נתחו את ההבדלים בין הקבוצות על ידי התוויית שטף זוהר כולל באזורי הגוף המעניינים.
לאחר צביעת NuMA באמצעות תוכנה, ציירו החזר על ההשקעה כדי לכלול את כל התאים המוכתמים של NuMA בתוך רקמת האיברים, למעט פרנכימה איברית אחרת וחללים ריקים. התאם את ההגדרות כדי לסווג את התאים החיוביים וה- NuMA השליליים של NuMA תוך שימוש בבקרות חיוביות ושליליות מתאימות עבור כל איבר. השתמש באלגוריתם תוכנה מבוסס כדי לכמת את המספר הכולל של האחוזים של תאים חיוביים של NuMA עבור כל דגימה.
תמונות ביולומינסנציה, שדה בהיר, אקס-ויוו פלואורסצנציה והמטוקסילין וצביעת אאוזין ממחישות את הגישה הרב-ראשית לניתוח השפעות הגנים המועמדים על גרורות מלנומה. השתקת Fucosyltransferase פגעה בהפצה גרורתית של תאי מלנומה. קטעי הריאות המוכתמים NuMA של תאי מלנומה הנגועים בנגיף לינדה בקרה ועם מדכא גרורות המבטא את נגיף לינדה מוצגים כאן.
תאי המלנומה הגרורתיים מסומנים בירוק ואזור האיברים תוחם על ידי קו ירוק בוקע. שמירה על מתח תקין בעור בעת ביצוע זריקות תוך-עוריות, הימנעות מתסחיף אוויר בעת הכנת מזרקים והשגת שולי כריתה נאותים שאינם אמורים להפריע לתנועה של החיה או לגרום לה לגרום לו לסיבוכי פצע, לעזור לשפר את שיעור ההצלחה ואת יכולת השכפול. שימוש נוסף בהדמיית מולטיפלקס כדי לבחון סינון חיסוני, ריצוף RNA של תאים בודדים לניתוח ביטוי גנים ותעתיקים מרחביים יכולים כולם לספק דרכים משלימות לבחינת ההטרוגניות התוך-תאית.
שילוב הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה סייע לנו לזהות מווסתים חדשים בגרורות במוח מלנומה, כגון תפקידה של מלנומה המופרשת על ידי עמילואיד בטא בדיכוי דלקת עצבית ובקידום גרורות במוח.
