Este protocolo describe una serie de técnicas dentro de un flujo de trabajo continuo que pueden utilizarse para evaluar los efectos in vivo de los candidatos reguladores de la metástasis del melanoma, pero también de la metástasis de otras neoplasias malignas sólidas. La principal ventaja de nuestro flujo de trabajo sistemático es una mayor reproducibilidad de los datos debido a modelos y técnicas in vivo robustos y estandarizados. Esta tubería ofrece una vía para el descubrimiento de objetivos y el desarrollo de terapias mediante la prueba de candidatos inferidos a partir de datos ómicos o ensayos in vitro en un entorno in vivo.
La curva de aprendizaje asociada a las técnicas presentadas en este protocolo se acorta utilizando los materiales proporcionados y siguiendo la descripción detallada al practicar los pasos. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Orlando Aristizabal, un científico investigador en The Preclinical Imaging Core y Ran Moubarak, un instructor en mi laboratorio. Para inyecciones intradérmicas, anestesia y afeita a un ratón de ocho a 10 semanas de edad dentro de un gabinete de bioseguridad mientras mantiene condiciones asépticas.
Luego agarre y retraiga la piel hacia atrás contra la trayectoria de la puñalada de la aguja y, con una aguja de jeringa de insulina de calibre 31 de seis milímetros de largo, perfore suavemente la piel en un ángulo agudo con el bisel hacia arriba. Inyecte 30 microlitros de la suspensión de células tumorales lentamente, hasta que se observe una rueda en forma de cúpula. Controle la progresión del crecimiento del tumor, la pérdida de peso y el estado de salud general.
Durante estas sesiones de monitoreo, tome medidas con pinzas y use las dimensiones de longitud y anchura del tumor para calcular el volumen. Para inyecciones intracardíacas, transfiera un ratón anestesiado a la plataforma calentada de la máquina de ultrasonido. Luego, con cinta hipoalergénica, asegure el mouse al cono de la nariz.
Afeitar el tórax con una cuchilla de afeitar recta o una hoja de bisturí, inclinada en un ángulo de 30 grados y limpiar la piel alrededor del área del procedimiento con 10% de povidona yodada. Luego, coloque la sonda de ultrasonido en el centro del tórax en el lado izquierdo del mouse para capturar una ventana horizontal orientada a obtener una vista transversal del ventrículo izquierdo. Con el eje largo de la sonda mirando hacia arriba, fije la sonda en un ángulo de 50 grados y la plataforma calentada en un ángulo de 20 grados, luego bloquee la sonda y el marco de soporte en la posición.
Mientras trabaja dentro del gabinete de seguridad, extraiga la suspensión celular en una jeringa de tuberculina de un mililitro con una aguja de una pulgada de calibre 30. Retire las burbujas de aire presentes en la jeringa. Bloquee la jeringa en el inyector estereotáctico.
Y luego, bajo guía de ultrasonido, avance la aguja a través de la pared torácica hacia el ventrículo izquierdo del corazón e inyecte de 100 a 250 microlitros de la suspensión de células tumorales lentamente. Para la cirugía de supervivencia por etapas, coloque el ratón anestesiado en la almohadilla de calentamiento y limpie la piel alrededor del área del procedimiento con una solución de yodo de povidona al 10%. Después de ponerse equipos estériles de protección personal y guantes, coloque una cortina estéril sobre el cuerpo del animal.
A continuación, con tijeras Iris o un bisturí, incise la piel, manteniendo un margen de resección de cinco a siete milímetros desde el borde del tumor. En caso de tumores intradérmicos, reseque el tumor junto con la piel circunferencial. Para los tumores subcutáneos, diseccionar y extirpar el tumor debajo de la piel.
Después de la resección del tumor, cierre la herida con un dispositivo de grapado de nueve milímetros. Para imágenes in vivo, administre sustrato de d-luciferina al ratón mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de insulina de un mililitro y una aguja de calibre 28, luego anestesia al ratón y colóquelo en un cono nasal dentro del escáner de imágenes de bioluminiscencia. Inicie el instrumento presionando inicializar y establezca el tiempo de exposición en automático.
Para capturar una imagen en blanco para la resta de fondo, haga clic en adquirir y guarde la imagen una vez completada la secuencia de adquisición. Para el análisis de datos y el mismo software de imágenes in vivo, navegue a la carpeta donde se guardan las imágenes y abra las imágenes de todos los ratones de un experimento. Configure las unidades a radiancia y asegúrese de que la casilla de verificación que indica individuo no esté marcada, ya que esto impedirá la normalización de la señal entre grupos.
A continuación, utilizando la herramienta de dibujo de región de interés o ROI, dibuje ROI circulares para la región del cerebro y ROI rectangulares para el cuerpo, excluya las orejas y la nariz en el ROI del cerebro, ya que tienden a emitir luminancia inespecífica. Para minimizar el sesgo, dibuje rois en las fotografías de los ratones sin la señal luminiscente superpuesta, luego seleccione medir el ROI para cuantificar la señal y exportar los datos a una hoja de cálculo. Analizar las diferencias entre grupos trazando el flujo luminiscente total en las regiones corporales de interés.
Después de una tinción de NuMA con software, dibuje un ROI para incluir todas las células teñidas de NuMA dentro del tejido del órgano, excepto otros parénquimas de órganos y espacios vacíos. Ajuste la configuración para categorizar las células NuMA positivas y NuMA negativas mientras usa los controles positivos y negativos apropiados para cada órgano. Utilice un algoritmo de software establecido para cuantificar el número total de porcentaje de células NuMA positivas para cada muestra.
La bioluminiscencia, el campo brillante, la fluorescencia ex vivo y las imágenes de tinción de hematoxilina y eosina ilustran el enfoque múltiple para el análisis de los efectos de los genes candidatos en la metástasis del melanoma. El silenciamiento de la fucosiltransferasa perjudicó la diseminación metastásica de las células de melanoma. Las secciones pulmonares teñidas de NuMA de células de melanoma infectadas con el virus Linda de control y con un supresor de metástasis que expresa el virus Linda se muestran aquí.
Las células de melanoma metastásico están marcadas de verde y el área del órgano está delimitada por una línea verde eclosionada. Mantener una tensión adecuada en la piel al realizar inyecciones intradérmicas, evitar la embolia aérea al preparar jeringas y obtener márgenes de resección adecuados que no interfieran con la locomoción del animal ni predispongan a complicaciones de la herida, ayudan a mejorar la tasa de éxito y la reproducibilidad. El empleo adicional de imágenes multiplex para examinar la filtración inmune, la secuenciación de ARN de una sola célula para el análisis de expresión génica y la transcriptómica espacial podrían proporcionar vías complementarias para examinar la heterogeneidad intratumoral.
La combinación de técnicas descritas en este protocolo nos ayudó a identificar nuevos reguladores en la metástasis cerebral del melanoma, como el papel del melanoma beta amiloide secretado en la supresión de la neuroinflamación y la promoción de la metástasis cerebral.
