Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Techniken innerhalb eines kontinuierlichen Workflows, die zur Beurteilung der In-vivo-Effekte von Kandidatenregulatoren der Melanommetastasierung, aber auch der Metastasierung anderer solider Malignome verwendet werden können. Der Hauptvorteil unseres systematischen Workflows ist die erhöhte Reproduzierbarkeit der Daten durch robuste und standardisierte In-vivo-Modelle und -Techniken. Diese Pipeline bietet einen Weg für die Entdeckung von Zielen und die Entwicklung von Therapien, indem Kandidaten getestet werden, die aus Omics-Daten oder In-vitro-Assays in einem In-vivo-Umfeld abgeleitet wurden.
Die Lernkurve, die mit den in diesem Protokoll vorgestellten Techniken verbunden ist, wird verkürzt, indem die bereitgestellten Materialien verwendet werden und die detaillierte Beschreibung beim Üben der Schritte befolgt wird. Orlando Aristizabal, ein Forscher im Preclinical Imaging Core, und Ran Moubarak, ein Ausbilder in meinem Labor, werden helfen, das Verfahren zu demonstrieren. Für intradermale Injektionen anästhesieren und rasieren Sie eine acht bis 10 Wochen alte Maus in einer Biosicherheitskabine unter Beibehaltung aseptischer Bedingungen.
Dann greifen und ziehen Sie die Haut rückwärts gegen die Flugbahn des Nadelstichs zurück und punktieren Sie mit einer sechs Millimeter langen, 31 Gauge Insulinspritzennadel vorsichtig die Haut in einem spitzen Winkel mit der Fase nach oben. Injizieren Sie 30 Mikroliter der Tumorzellsuspension langsam, bis ein kuppelförmiges Rad beobachtet wird. Überwachen Sie das Fortschreiten des Tumorwachstums, den Gewichtsverlust und den allgemeinen Gesundheitszustand.
Nehmen Sie während dieser Überwachungssitzungen Messungen mit Messschiebern vor und verwenden Sie die Längen- und Breitenmaße des Tumors, um das Volumen zu berechnen. Für intrakardiale Injektionen übertragen Sie eine betäubte Maus auf die beheizte Plattform des Ultraschallgeräts. Befestigen Sie dann mit hypoallergenem Klebeband die Maus am Nasenkonus.
Rasieren Sie den Thorax mit einer geraden Rasierklinge oder einer Skalpellklinge, die in einem Winkel von 30 Grad geneigt ist, und reinigen Sie die Haut um den Eingriffsbereich mit 10% Povidonjod. Positionieren Sie dann die Ultraschallsonde in der Mitte des Thorax auf der linken Seite der Maus, um ein horizontales Fenster zu erfassen, das auf eine Querschnittsansicht des linken Ventrikels ausgerichtet ist. Wenn die Längsachse der Sonde nach oben zeigt, fixieren Sie die Sonde in einem Winkel von 50 Grad und die beheizte Plattform in einem Winkel von 20 Grad, und verriegeln Sie dann die Sonde und den Stützrahmen in der Position.
Während Sie in der Sicherheitswerkbank arbeiten, ziehen Sie die Zellsuspension in einer Tuberkulin-Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Ein-Zoll-Nadel auf. Entfernen Sie alle in der Spritze vorhandenen Luftblasen. Verriegeln Sie die Spritze im stereotaktischen Injektor.
Und dann unter Ultraschallanleitung die Nadel durch die Brustwand in den linken Ventrikel des Herzens schieben und 100 bis 250 Mikroliter der Tumorzellsuspension langsam injizieren. Für eine inszenierte Überlebensoperation legen Sie die betäubte Maus auf das wärmende Pad und reinigen Sie die Haut um den Eingriffsbereich mit einer 10% igen Povidon-Jodlösung. Nachdem Sie sterile persönliche Schutzausrüstung und Handschuhe angezogen haben, legen Sie einen sterilen Vorhang über den Körper des Tieres.
Als nächstes schneiden Sie mit einer Irisschere oder einem Skalpell die Haut ein und halten einen Resektionsrand von fünf bis sieben Millimetern vom Rand des Tumors aufrecht. Bei intradermalen Tumoren resektieren Sie den Tumor zusammen mit der umlaufenden Haut. Bei subkutanen Tumoren sezieren und entfernen Sie den Tumor unter der Haut.
Schließen Sie nach der Tumorresektion die Wunde mit einer neun Millimeter großen Klammervorrichtung. Für die In-vivo-Bildgebung verabreichen Sie der Maus ein d-Luciferin-Substrat durch intraperitoneale Injektion mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze und einer 28-Gauge-Nadel, betäuben Sie die Maus und legen Sie sie in einen Nasenkegel im Biolumineszenz-Bildgebungsscanner. Starten Sie das Instrument, indem Sie auf Initialisieren drücken und die Belichtungszeit auf Auto einstellen.
Um ein leeres Bild für die Hintergrundsubtraktion zu erfassen, klicken Sie auf Erfassen und speichern Sie das Bild, nachdem die Aufnahmesequenz abgeschlossen ist. Für die Datenanalyse und die gleiche In-vivo-Bildgebungssoftware navigieren Sie zu dem Ordner, in dem die Bilder gespeichert sind, und öffnen Sie die Bilder aller Mäuse aus einem Experiment. Stellen Sie die Einheiten auf Strahldichte ein und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen, das die Person anzeigt, nicht aktiviert ist, da dies eine gruppenübergreifende Normalisierung des Signals ausschließt.
Als nächstes zeichnen Sie mit dem Region of Interest oder ROI-Zeichenwerkzeug kreisförmige ROIs für die Gehirnregion und rechteckige ROIs für den Körper, schließen Sie die Ohren und die Nase im Gehirn ROI aus, da sie dazu neigen, unspezifische Luminanz zu emittieren. Um Verzerrungen zu minimieren, zeichnen Sie ROIs auf den Fotos der Mäuse, ohne dass das lumineszierende Signal überlagert ist, und wählen Sie dann die ROIs messen, um das Signal zu quantifizieren und die Daten in eine Tabelle zu exportieren. Analysieren Sie Unterschiede zwischen Gruppen, indem Sie den Gesamtlumineszenzfluss in interessierenden Körperregionen aufzeichnen.
Zeichnen Sie nach einer NuMA-Färbung mit Software einen ROI, um alle NuMA-gefärbten Zellen im Organgewebe einzubeziehen, mit Ausnahme anderer Organparenchyme und leerer Räume. Passen Sie die Einstellungen an, um die NuMA-positiven und NuMA-negativen Zellen zu kategorisieren, während Sie für jedes Organ geeignete Positiv- und Negativkontrollen verwenden. Verwenden Sie einen etablierten Softwarealgorithmus, um die Gesamtzahl des Prozentsatzes der NuMA-positiven Zellen für jede Probe zu quantifizieren.
Biolumineszenz-, Hellfeld-, Ex-vivo-Fluoreszenz- und Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsbilder veranschaulichen den mehrgleisigen Ansatz zur Analyse der Auswirkungen von Kandidatengenen auf die Melanommetastasierung. Fucosyltransferase-Stummschaltung beeinträchtigte die metastatische Verbreitung von Melanomzellen. Die NuMA-gefärbten Lungenabschnitte von Melanomzellen, die mit dem Linda-Kontrollvirus und mit einem Metastasensuppressor infiziert sind, der das Linda-Virus exprimiert, sind hier dargestellt.
Die metastasierenden Melanomzellen sind grün markiert und der Organbereich wird durch eine grün schraffierte Linie abgegrenzt. Die Aufrechterhaltung der richtigen Spannung in der Haut bei der Durchführung intradermaler Injektionen, die Vermeidung von Luftembolien bei der Herstellung von Spritzen und die Erzielung angemessener Resektionsränder, die die Fortbewegung des Tieres nicht beeinträchtigen oder für Wundkomplikationen prädisponieren sollten, tragen zur Verbesserung der Erfolgsrate und Reproduzierbarkeit bei. Der weitere Einsatz von Multiplex-Bildgebung zur Untersuchung der Immunfiltration, Einzelzell-RNA-Sequenzierung für die Genexpressionsanalyse und räumliche Transkriptomik könnte alle komplementäre Wege zur Untersuchung der intratumoralen Heterogenität bieten.
Die Kombination der in diesem Protokoll beschriebenen Techniken half uns, neue Regulatoren bei Melanom-Hirnmetastasen zu identifizieren, wie z.B. die Rolle von Melanom-sezerniertem Amyloid-Beta bei der Unterdrückung von Neuroinflammation und der Förderung von Hirnmetastasen.
