Este protocolo descreve uma série de técnicas dentro de um fluxo de trabalho contínuo que pode ser usado para avaliar os efeitos in vivo dos reguladores candidatos da metástase de melanoma, mas também de metástases de outras malignidades sólidas. A principal vantagem do nosso fluxo de trabalho sistemático é o aumento da reprodutibilidade dos dados devido a modelos e técnicas in vivo robustas e padronizadas. Este pipeline oferece um caminho para o desenvolvimento de descoberta e terapia de alvos, testando candidatos inferidos a partir de dados da Omics ou ensaios in vitro em um ambiente in vivo.
A curva de aprendizagem associada às técnicas apresentadas neste protocolo é encurtada utilizando os materiais fornecidos e seguindo a descrição detalhada na prática das etapas. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Orlando Aristizabal, um cientista pesquisador do The Preclinical Imaging Core e Ran Moubarak, um instrutor do meu laboratório. Para injeções intradérmicas, anestesia e raspar um rato de oito a 10 semanas dentro de um armário de biossegurança, mantendo condições assépticas.
Em seguida, segure e retraia a pele para trás contra a trajetória da facada da agulha e usando uma agulha de seringa de insulina de 6 milímetros de comprimento e 31, perfurar suavemente a pele em um ângulo agudo com o bisel voltado para cima. Injete 30 microliters da suspensão da célula tumoral lentamente, até que uma roda em forma de cúpula seja observada. Monitore a progressão do crescimento do tumor, perda de peso e estado de saúde geral.
Durante essas sessões de monitoramento, faça medições com pinças e use as dimensões de comprimento e largura do tumor para calcular o volume. Para injeções intracardicascascas, transfira um rato anestesiado para a plataforma aquecida da máquina de ultrassom. Em seguida, usando fita hipoalergênica, fixe o mouse no cone do nariz.
Raspe o tórax com uma lâmina de barbear reto ou uma lâmina de bisturi, inclinada em um ângulo de 30 graus e limpe a pele ao redor da área de procedimento com iodo de 10% povidone. Em seguida, posicione a sonda de ultrassom no meio do tórax no lado esquerdo do mouse para capturar uma janela horizontal orientada para obter uma visão transversal do ventrículo esquerdo. Com o eixo longo da sonda voltada para cima, fixe a sonda em um ângulo de 50 graus e a plataforma aquecida em um ângulo de 20 graus, em seguida, bloqueie a sonda e o quadro de suporte na posição.
Enquanto trabalha dentro do gabinete de segurança, elasenhe a suspensão celular em uma seringa de um mililitro com uma agulha de 30 metros de altura. Remova as bolhas de ar presentes na seringa. Bloqueie a seringa no injetor estereotático.
E então, sob orientação de ultrassom, avance a agulha através da parede torácica no ventrículo esquerdo do coração e injete de 100 a 250 microliters da suspensão celular tumoral lentamente. Para a cirurgia de sobrevivência encenada, coloque o rato anestesiado na almofada de aquecimento e limpe a pele ao redor da área de procedimento com uma solução de iodo de 10% povidone. Depois de vestir equipamentos e luvas estéreis de proteção pessoal, coloque uma cortina estéril sobre o corpo do animal.
Em seguida, usando uma tesoura Iris ou um bisturi, inciso a pele, mantendo uma margem de ressecção de cinco a sete milímetros da borda do tumor. No caso de tumores intradérmicos, ressecente o tumor junto com a pele circunferencial. Para tumores subcutâneos, disseca e remova o tumor sob a pele.
Após a ressecção do tumor, feche a ferida com um dispositivo de grampeamento de nove milímetros. Para a imagem in vivo, administre o substrato d-luciferina ao camundongo por injeção intraperitoneal com uma seringa de insulina de um mililitro e uma agulha de calibre 28, em seguida, anestesiar o rato e colocá-lo em um cone de nariz dentro do scanner de imagem bioluminescência. Inicie o instrumento pressionando e ajuste o tempo de exposição para auto.
Para capturar uma imagem em branco para subtração em segundo plano, clique em adquirir e salvar a imagem após a sequência de aquisição ser concluída. Para análise de dados e o mesmo software de imagem in vivo, navegue até a pasta onde as imagens são salvas e abra as imagens de todos os ratos de um experimento. Defina as unidades para o brilho e certifique-se de que a caixa de seleção que indica o indivíduo não seja verificada, pois isso impedirá a normalização do sinal entre os grupos.
Em seguida, usando a região de interesse ou ferramenta de desenho de ROI, desenhe ROIs circulares para a região cerebral e ROI retangular para o corpo, exclua as orelhas e o nariz no ROI cerebral, pois eles tendem a emitir luminância inespecífica. Para minimizar o viés, desenhe os ROI's nas fotografias dos ratos sem o sinal luminescente sobreposto e, em seguida, selecione medir os ROI's para quantificar o sinal e exportar os dados para uma planilha. Analise as diferenças entre os grupos, traçando fluxo luminescente total em regiões de interesse do corpo.
Após uma coloração numa usando software, desenhe um ROI para incluir todas as células manchadas de NuMA dentro do tecido do órgão, exceto outros órgãos parenchyma e espaços vazios. Ajuste as configurações para categorizar as células negativas NuMA positiva e NuMA, utilizando controles positivos e negativos apropriados para cada órgão. Use um algoritmo de software estabelecido para quantificar o número total de células positivas do NuMA para cada amostra.
Imagens de bioluminescência, campo brilhante, fluorescência ex vivo e imagens de coloração de hematoxilina e eosina ilustram a abordagem multifacetada para a análise dos efeitos dos genes candidatos na metástase do melanoma. O silenciamento de fucosyltransferase prejudicou a disseminação metastática das células de melanoma. As seções pulmonares manchadas do NuMA de células de melanoma infectadas com o vírus de Controle Linda e com um supressor de metástase expressando o vírus Linda são mostradas aqui.
As células de melanoma metastático são rotuladas de verde e a área do órgão é delimitada por uma linha verde eclodida. Manter a tensão adequada na pele ao realizar injeções intradérmicas, evitar embolias de ar ao preparar seringas e obter margens adequadas de ressecção que não devem interferir na locomoção do animal ou predispor-na a complicações de feridas, ajudar a melhorar a taxa de sucesso e a reprodutibilidade. O emprego adicional de imagens multiplex para examinar a filtragem imunológica, o sequenciamento de RNA de células únicas para análise de expressão genética e transcrição espacial poderia fornecer caminhos complementares para examinar a heterogeneidade intratumoral.
A combinação de técnicas descritas neste protocolo nos ajudou a identificar novos reguladores na metástase cerebral do melanoma, como o papel do melanoma secretado beta amiloide na supressão da neuroinflamação e na promoção da metástase cerebral.
