يمكن أن تعالج طريقة qRT-PCR هذه الأسئلة المتعلقة بتنميط تعبير الحمض النووي الريبي الميكروي في مصل الفئران في ظروف مثل القصور الكلوي المعتمد على العمر. تمكن هذه التقنية من اكتشاف تعبير microRNA بدقة وحساسية عالية من خلال عملية بسيطة توفر الوقت وتمنع الخطأ الفني. للبدء ، قم بشق جلد البطن باستخدام ملاقط ومقص جراحي.
قطع العضلات في الغشاء البريتوني من المثانة إلى الحافة اليسرى السفلى من الأضلاع. ارفع الغشاء البريتوني باستخدام ملاقط ، وقم بعمل شق جانبي في الحافة العلوية باستخدام مقص جراحي. استمر في الشق على طول الحافة السفلية للأضلاع.
حدد الوريد الأجوف السفلي باستخدام مسحتين من القطن المبلل بواسطة PBS. أدخل إبرة 30 جم متصلة بحقنة 1 ملليلتر في الوريد الأجوف السفلي ، واسحب المحقنة. اسحب الإبرة ببطء لتجنب انحلال الدم.
انقل الدم إلى أنبوب سبيتز 1 ملليلتر مع الهيبارين ، واخلطه عن طريق الانعكاس. قم بالطرد المركزي لأنبوب سبيتز لمدة 10 دقائق عند 3000 مرة من الغرام في درجة حرارة الغرفة. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.
خذ 200 ميكرولتر من عينة المصل ، وأضف 1000 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول / جوانيدين. دوامة الخليط لمدة 5 ثوان ، وحضانت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، واخلطها عن طريق عكس الأنبوب 15 مرة.
احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق ، تليها الطرد المركزي. دون إزعاج الكريات ، انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 450 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، ودوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان.
ثم قم بتحميل 700 ميكرولتر من العينة على عمود دوران مثبت بالغشاء ، وقم بطرده مركزيا. تخلص من التدفق ، وأضف 700 ميكرولتر من Wash Buffer 1 المتوفرة في المجموعة. جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، وتخلص من التدفق من خلاله.
كرر الغسيل مع 500 ميكرولتر من Wash Buffer 2 لإزالة الأملاح النزرة. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول ، وأجهزة الطرد المركزي ، وتخلص من التدفق من أنبوب التجميع. قم بالطرد المركزي لعمود الدوران مرة أخرى ، وانقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 ملليلتر.
ثم أضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير العمود مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 15000 مرة G في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد محلول خلط رئيسي ، وأضف 8 ميكرولترات لكل بئر في أنبوب شريط 8 آبار.
أضف 12 ميكرولترا من إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج في كل أنبوب، وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 ثانية عند 2000 مرة من G في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري ، وابدأ الحضانة لتوليف cDNA. بعد الحضانة ، انقل cDNA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
تمييع cDNA عشرة أضعاف مع الماء المقطر. ثم دوامة ، تليها الطرد المركزي لمدة 5 ثوان في 2000 مرة G في درجة حرارة الغرفة. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، قم بإعداد محلول المزيج الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص ، ودوامة المحلول.
أضف 22.5 ميكرولتر أليكوت في كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، متبوعا ب 2.5 ميكرولتر من cDNA. أغلق اللوحة باستخدام فيلم لاصق ، وقم بالطرد المركزي للصفيحة لمدة 30 ثانية عند 1000 مرة G.ضع اللوحة في نظام PCR في الوقت الفعلي. عدل الإعدادات عن طريق توفير اسم للتجربة.
ثم حدد 96-well 0.2 ملليلتر كنوع التجربة ، والتصوير المقطعي المحوسب المقارن كطريقة القياس الكمي ، والمعيار كوضع تشغيل النظام ، وكواشف SYBR Green ككواشف للكشف عن التسلسل المستهدف. قدم أسماء للعينة والحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف في كل بئر. قم بتعيين عينات مكررة، واختر عينة مرجعية وعنصر تحكم داخلي، وحدد لا شيء للصبغة لاستخدامها كمرجع سلبي.
للقضاء على التلوث المتبادل للكاشف، قم بإعداد النسخ العكسي السلبي وعنصر تحكم غير قالب لتعبير miRNA. بعد ذلك تأكد من ضبط حجم التفاعل على 20 ميكرولتر، وضبط ظروف دورة PCR على 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 40 دورة من تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتمديد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بعد اكتمال العملية ، انقر فوق تحليل لتحليل بيانات qRT-PCR.
تأكد من أن خط العتبة الذي يحدده البرنامج تلقائيا مناسب لكل بئر. تحقق من قيمة دورة العتبة للتحكم الداخلي والحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف الذي تم تحليله في كل عينة. أوجد قيم التصوير المقطعي المحوسب عن طريق تقاطع منحنى التضخيم وخط العتبة.
أظهرت بيانات miRNA qRT-PCR لنموذج القصور الكلوي المعتمد على العمر أنه بالمقارنة مع الفئران الضابطة SAMR1 ، زاد مستوى الكلى من miRNA-7219-5p بشكل كبير في الفئران التجريبية SAMP1 ، في حين انخفض مستوى الكلى من miRNA-7218-5p. لم تتغير مستويات التعبير عن miRNA-223-3p في أي من السلالتين. زادت مستويات المصل لكل من miRNA-7219-5p و miRNA-7218-5p بشكل كبير في فئران SAMP1 ، في حين أن مستويات miRNA-223-3p لم تتغير.
يجب عليك إدخال الإبرة في الوريد الأجوف السفلي واستخراج الدم دون اختراق الوعاء. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في تنميط تعبير microRNA في مصل الفئران لمجموعة واسعة من الحالات المرضية.
