Diese qRT-PCR-Methode kann Fragen im Zusammenhang mit der Erstellung von microRNA-Expressionsprofilen im Serum von Mäusen unter Bedingungen wie altersabhängiger Nierenfunktionsstörung beantworten. Die Technik ermöglicht den Nachweis der microRNA-Expression mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit durch einen einfachen Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert. Um zu beginnen, schneiden Sie die Haut des Bauches mit Pinzette und chirurgischer Schere.
Schneiden Sie die Muskeln in der Peritonealmembran von der Blase bis zum unteren linken Rand der Rippen. Heben Sie die Peritonealmembran mit einer Pinzette an und machen Sie einen seitlichen Schnitt am oberen Rand mit einer chirurgischen Schere. Setzen Sie den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen fort.
Identifizieren Sie die untere Hohlvene mit zwei PBS-befeuchteten Wattestäbchen. Führen Sie eine 30-G-Nadel, die an einer 1-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die Vena cava inferior ein und ziehen Sie die Spritze. Ziehen Sie die Nadel langsam heraus, um Hämolyse zu vermeiden.
Übertragen Sie das Blut in ein 1-Milliliter-Spitzröhrchen mit Heparin und mischen Sie es durch Invertieren. Zentrifugieren Sie das Spitzrohr für 10 Minuten bei 3000 mal G bei Raumtemperatur. Den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Nehmen Sie 200 Mikroliter Serumprobe und fügen Sie 1.000 Mikroliter Phenol / Guanidin-basiertes Lysereagenz hinzu. Wirbeln Sie die Mischung für 5 Sekunden und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen Sie, indem Sie die Tube 15 Mal umdrehen.
Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 3 Minuten, gefolgt von der Zentrifugation. Ohne das Pellet zu stören, wird der Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Fügen Sie 450 Mikroliter 100% Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Röhre für 5 Sekunden.
Laden Sie dann 700 Mikroliter der Probe auf eine membranverankerte Spinsäule und zentrifugieren Sie sie. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie 700 Mikroliter Waschpuffer 1 hinzu, der im Kit enthalten ist. Zentrifugieren Sie erneut, und verwerfen Sie den Durchfluss.
Wiederholen Sie das Waschen mit 500 Mikrolitern Wash Buffer 2, um Spurensalze zu entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter 80% Ethanol hinzu, zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Durchfluss aus dem Sammelrohr. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule erneut und geben Sie die Säule in ein frisches 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen.
Dann fügen Sie 14 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu und inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Säule erneut für 1 Minute bei 15000 mal G bei Raumtemperatur. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor und fügen Sie 8 Mikroliter pro Vertiefung in ein 8-Well-Streifenrohr hinzu.
Fügen Sie 12 Mikroliter der extrahierten Gesamt-RNA in jedes Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen für 15 Sekunden bei 2000 mal G bei Raumtemperatur. Legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und starten Sie die Inkubation, um die cDNA zu synthetisieren. Nach der Inkubation wird die cDNA in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Verdünnen Sie die cDNA zehnfach mit destilliertem Wasser. Dann Wirbel, gefolgt von Zentrifugation für 5 Sekunden bei 2000 mal G bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen die Master-Mix-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben vor und wirbeln Sie die Lösung durch.
Fügen Sie 22,5 Mikroliter Aliquots in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu, gefolgt von 2,5 Mikrolitern cDNA. Versiegeln Sie die Platte mit einem Klebefilm und zentrifugieren Sie die Platte 30 Sekunden lang mit dem 1000-fachen G.Legen Sie die Platte in das real-time PCR-System. Ändern Sie die Einstellungen, indem Sie einen Namen für das Experiment angeben.
Wählen Sie dann 96-well 0,2 Milliliter als Experimenttyp, vergleichende CT als Quantifizierungsmethode, Standard als Systemlaufmodus und SYBR Green-Reagenzien als Reagenzien zum Nachweis der Zielsequenz. Geben Sie Namen für die Probe und die Ziel-miRNA in jeder Vertiefung an. Weisen Sie doppelte Proben zu, wählen Sie eine Referenzprobe und eine endogene Kontrolle aus, und wählen Sie keine für den Farbstoff aus, der als passive Referenz verwendet werden soll.
Um eine Reagenzkreuzkontamination zu eliminieren, richten Sie eine negative Reverse-Transkriptase und eine Nicht-Template-Kontrolle für die miRNA-Expression ein. Als nächstes stellen Sie sicher, dass das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter eingestellt wird und die PCR-Zyklusbedingungen für 15 Minuten auf 95 Grad Celsius eingestellt werden, dann 40 Denaturierungszyklen bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, Glühen bei 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und Verlängerung bei 70 Grad Celsius für 30 Sekunden. Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf Analysieren, um die qRT-PCR-Daten zu analysieren.
Vergewissern Sie sich, dass die vom Programm automatisch ausgewählte Schwellenwertlinie für jede Vertiefung geeignet ist. Überprüfen Sie den Schwellenwert-Zykluswert der endogenen Kontroll- und Ziel-miRNAs, die in jeder Probe analysiert wurden. Bestimmen Sie die CT-Werte durch den Schnittpunkt der Verstärkungskurve und der Schwellenwertlinie.
miRNA qRT-PCR-Daten für das altersabhängige Modell der Nierenfunktionsstörung zeigten, dass im Vergleich zu SAMR1-Kontrollmäusen der Nierenspiegel von miRNA-7219-5p bei SAMP1-Versuchsmäusen signifikant anstieg, während der Nierenspiegel von miRNA-7218-5p abnahm. Die Expressionsniveaus von miRNA-223-3p änderten sich in keinem der beiden Stämme. Die Serumspiegel von miRNA-7219-5p und miRNA-7218-5p waren in den SAMP1-Mäusen erheblich erhöht, während die Spiegel von miRNA-223-3p unverändert blieben.
Sie sollten die Nadel in die Vena cava inferior einführen und Blut entnehmen, ohne in das Gefäß einzudringen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im microRNA-Expressionsprofil in Mäuseserum für eine Vielzahl von pathologischen Zuständen zu beantworten.
