이 qRT-PCR 방법은 연령 의존적 신장 손상과 같은 조건에서 마우스의 혈청에서 microRNA 발현 프로파일링과 관련된 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 공정으로 높은 정확도와 감도로 microRNA 발현을 검출할 수 있습니다. 시작하려면 핀셋과 수술 용 가위를 사용하여 복부의 피부를 절개하십시오.
복막 막의 근육을 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 복막막을 들어 올리고 수술 용 가위로 위쪽 가장자리를 측면 절개하십시오. 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속하십시오.
두 개의 PBS에 적신 면봉을 사용하여 하대 정맥을 식별하십시오. 1 밀리리터 주사기에 부착 된 30G 바늘을 하대 정맥에 삽입하고 주사기를 당깁니다. 용혈을 피하기 위해 바늘을 천천히 당겨 빼냅니다.
혈액을 헤파린이 든 1 밀리리터 스 피츠 튜브로 옮기고 뒤집어서 혼합하십시오. 실온에서 3000배 G에서 10분 동안 스피츠 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
200 마이크로 리터의 혈청 샘플을 채취하고 1, 000 마이크로 리터의 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약을 첨가하십시오. 혼합물을 5초 동안 와동시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 200 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 튜브를 15 번 뒤집어 혼합합니다.
샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 450 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 넣고 튜브를 5 초 동안 볼텍스하십시오.
그런 다음 700마이크로리터의 샘플을 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 로드하고 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기하고, 키트에 제공된 700 마이크로리터의 세척 완충액 1을 추가한다. 다시 원심 분리하고 플로우 스루를 폐기하십시오.
미량 염분을 제거하기 위해 500 마이크로리터의 세척 버퍼 2로 세척을 반복합니다. 500 마이크로 리터의 80 % 에탄올을 추가하고 원심 분리기를 넣고 수집 튜브에서 플로우 스루를 버립니다. 스핀 컬럼을 다시 원심분리하고 컬럼을 새로운 1.5밀리리터 수집 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 14 마이크로 리터의 RNase가없는 물을 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 컬럼을 실온에서 15000배 G로 1분간 다시 돌린다. 마스터 믹스 용액을 준비하고 8웰 스트립 튜브에 웰당 8마이크로리터를 추가합니다.
추출된 총 RNA 12 마이크로리터를 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 실온에서 2000배 G에서 15초 동안 원심분리한다. 튜브를 열 순환기에 넣고 배양을 시작하여 cDNA를 합성합니다. 배양 후 cDNA를 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
cDNA를 증류수로 10배 희석한다. 그 후 와동시키고, 실온에서 2000배 G에서 5초간 원심분리하였다. 마이크로 원심분리 튜브에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마스터 믹스 용액을 준비하고 용액을 와동시킵니다.
96웰 플레이트의 각 웰에 22.5마이크로리터 분취량을 추가한 다음 2.5마이크로리터의 cDNA를 추가합니다. 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 플레이트를 1000회 G.Place에서 30초 동안 원심분리하여 플레이트를 실시간 PCR 시스템에 배치한다. 실험의 이름을 제공하여 설정을 수정합니다.
그런 다음 실험 유형으로 96-well 0.2ml, 정량 방법으로 비교 CT, 시스템 실행 모드로 표준, 표적 서열 검출 시약으로 SYBR Green 시약을 선택합니다. 각 웰의 샘플 및 표적 miRNA의 이름을 제공합니다. 중복 샘플을 할당하고, 참조 샘플과 내인성 대조군을 선택하고, 수동 참조로 사용할 염료에 대해 없음을 선택합니다.
시약 교차 오염을 제거하려면 miRNA 발현을 위한 음성 역전사효소 및 비주형 대조군을 설정합니다. 다음으로 반응 부피가 20 마이크로 리터로 설정되고 PCR 사이클링 조건이 섭씨 95도에서 15 분 동안 설정된 다음 섭씨 94도에서 15 초 동안 변성 40 사이클, 섭씨 55도에서 30 초 동안 어닐링, 섭씨 70도에서 30 초 동안 확장됩니다. 프로세스가 완료되면 분석을 클릭하여 qRT-PCR 데이터를 분석합니다.
프로그램에서 자동으로 선택한 임계값 선이 각 웰에 적합한지 확인합니다. 각 샘플에서 분석된 내인성 대조군 및 표적 miRNA의 역치 주기 값을 확인하였다. 증폭 곡선과 역치 선의 교차점으로 CT 값을 결정하십시오.
연령 의존적 신장 손상 모델에 대한 miRNA qRT-PCR 데이터는 SAMR1 대조군 마우스와 비교하여 SAMP1 실험 마우스에서 miRNA-7219-5p의 신장 수준이 유의하게 증가한 반면 miRNA-7218-5p의 신장 수준은 감소하는 것으로 나타났습니다. miRNA-223-3p의 발현 수준은 어느 균주에서도 변하지 않았다. miRNA-7219-5p 및 miRNA-7218-5p의 혈청 수준은 SAMP1 마우스에서 상당히 증가한 반면, miRNA-223-3p의 수준은 변하지 않았다.
하대 정맥에 바늘을 삽입하고 혈관을 관통하지 않고 혈액을 추출해야합니다. 이 방법은 광범위한 병리학적 상태에 대한 마우스 혈청의 microRNA 발현 프로파일링에서 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.
