Bu qRT-PCR yöntemi, yaşa bağlı böbrek yetmezliği gibi durumlarda farelerin serumunda mikroRNA ekspresyon profillemesi ile ilgili soruları ele alabilir. Bu teknik, mikroRNA ekspresyonunun yüksek doğruluk ve hassasiyetle tespitini, zamandan tasarruf sağlayan ve teknik hataları önleyen basit bir işlemle mümkün kılar. Başlamak için, cımbız ve cerrahi makas kullanarak karın derisini kesin.
Periton zarındaki kasları mesaneden kaburgaların sol alt kenarına kadar kesin. Cımbız kullanarak periton zarını kaldırın ve cerrahi makasla üst kenarda yanal bir kesi yapın. Kaburgaların en alt kenarı boyunca insizyona devam edin.
İnferior vena kavayı iki PBS nemlendirilmiş pamuklu çubuk kullanarak tanımlayın. 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 30 G'lik bir iğneyi inferior vena kavaya yerleştirin ve şırıngayı çekin. Hemolizi önlemek için iğneyi yavaşça çekin.
Kanı heparin ile 1 mililitrelik bir spitz tüpüne aktarın ve ters çevirerek karıştırın. Spitz tüpünü oda sıcaklığında 3000 kez G'de 10 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
200 mikrolitre serum örneği alın ve 1.000 mikrolitre fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi ekleyin. Karışımı 5 saniye boyunca vorteks yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü 15 kez ters çevirerek karıştırın.
Numuneyi oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin, ardından santrifüjleme yapın. Pelet'i rahatsız etmeden, süpernatantı taze 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 450 mikrolitre% 100 etanol ekleyin ve tüpü 5 saniye boyunca vorteksleyin.
Daha sonra numunenin 700 mikrolitresini membranla ankrajlı bir spin kolonuna yükleyin ve santrifüj yapın. Akışı atın ve kitte bulunan 700 mikrolitre Yıkama Arabelleği 1'i ekleyin. Tekrar santrifüj yapın ve akışı atın.
İz tuzları gidermek için 500 mikrolitre Yıkama Tamponu 2 ile tekrar yıkayın. 500 mikrolitre% 80 etanol, santrifüj ekleyin ve akışı toplama tüpünden atın. Sıkma kolonunu tekrar santrifüj yapın ve kolonu 1,5 mililitrelik taze bir toplama tüpüne aktarın.
Daha sonra 14 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kolonu oda sıcaklığında 15000 kez G'de 1 dakika boyunca tekrar döndürün. Bir ana karışım çözeltisi hazırlayın ve 8 delikli bir şerit tüpüne kuyucuk başına 8 mikrolitre ekleyin.
Her tüpe ekstrakte edilen toplam RNA'nın 12 mikrolitresini ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 2000 kez G'de 15 saniye boyunca santrifüj edin. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve cDNA'yı sentezlemek için inkübasyonu başlatın. Kuluçkadan sonra, cDNA'yı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
cDNA'yı damıtılmış suyla on kat seyreltin. Daha sonra vorteks, ardından oda sıcaklığında 2000 kez G'de 5 saniye santrifüjleme. Bir mikrosantrifüj tüpünde, ana karışım çözeltisini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve çözeltiyi vorteksleyin.
96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 22.5 mikrolitre alikot ekleyin, ardından 2.5 mikrolitre cDNA ekleyin. Plakayı yapışkan bir film kullanarak kapatın ve plakayı 1000 kez 30 saniye boyunca santrifüj yapın G.Plakayı gerçek zamanlı PCR sistemine yerleştirin. Deneme için bir ad sağlayarak ayarları değiştirin.
Ardından, deney türü olarak 96 kuyucuklu 0,2 mililitreyi, kantitasyon yöntemi olarak karşılaştırmalı BT'yi, sistem çalışma modu olarak standardı ve hedef sırayı algılamak için reaktifler olarak SYBR Green reaktiflerini seçin. Her bir kuyucuktaki örnek ve hedef miRNA için isimler sağlayın. Yinelenen örnekler atayın, bir referans numune ve endojen kontrol seçin ve pasif referans olarak kullanılacak boya için hiçbirini seçin.
Reaktif çapraz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için, negatif ters transkriptaz ve miRNA ekspresyonu için şablon olmayan bir kontrol ayarlayın. Daha sonra reaksiyon hacminin 20 mikrolitreye ayarlandığından ve PCR döngü koşullarının 15 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlandığından, daha sonra 15 saniye boyunca 94 santigrat derecede 40 döngü denatürasyona, 30 saniye boyunca 55 santigrat derecede tavlamanın ve 30 saniye boyunca 70 santigrat derecede uzatmanın ayarlandığından emin olun. İşlem tamamlandıktan sonra, qRT-PCR verilerini analiz etmek için analiz et'e tıklayın.
Program tarafından otomatik olarak seçilen eşik çizgisinin her kuyu için uygun olduğunu onaylayın. Endojen kontrolün eşik döngü değerini kontrol edin ve her numunede analiz edilen miRNA'ları hedefleyin. CT değerlerini, amplifikasyon eğrisinin ve eşik çizgisinin kesişimine göre belirleyin.
Yaşa bağlı böbrek yetmezliği modeli için miRNA qRT-PCR verileri, SAMR1 kontrol farelerine kıyasla, SAMP1 deneysel farelerde miRNA-7219-5p'nin böbrek seviyesinin önemli ölçüde arttığını, miRNA-7218-5p'nin böbrek seviyesinin azaldığını göstermiştir. MiRNA-223-3p'nin ekspresyon seviyeleri her iki suşta da değişmedi. Hem miRNA-7219-5p hem de miRNA-7218-5p'nin serum seviyeleri SAMP1 farelerde önemli ölçüde artarken, miRNA-223-3p seviyeleri değişmedi.
İğneyi inferior vena kavaya sokmalı ve damara nüfuz etmeden kan çıkarmalısınız. Bu yöntem, çok çeşitli patolojik durumlar için fare serumunda mikroRNA ekspresyon profillemesindeki kilit soruları cevaplamak için kullanılabilir.
