年龄依赖性肾损伤小鼠肾脏和血清中MicroRNA表达的定量实时聚合酶链反应评估

这种qRT-PCR方法可以解决与年龄依赖性肾损伤等条件下小鼠血清中microRNA表达谱相关的问题。该技术能够通过简单的过程以高精度和灵敏度检测microRNA表达，从而节省时间并防止技术错误。首先，用镊子和手术剪刀切开腹部皮肤。

切开腹膜中的肌肉，从膀胱到肋骨的左下边缘。用镊子提起腹膜，并用手术剪刀在上边缘做一个横向切口。继续沿着肋骨的最低边缘切口。

使用两根 PBS 湿棉签识别下腔静脉。将连接到1毫升注射器的30G针头插入下腔静脉，然后拉动注射器。慢慢拔出针头以避免溶血。

将血液转移到装有肝素的1毫升斯皮茨管中，并通过倒置混合。在室温下以3000倍G离心斯皮茨管10分钟。将上清液转移到新鲜的1.5毫升微量离心管中。

取200微升血清样品，加入1， 000微升苯酚/胍基裂解试剂。将混合物涡旋5秒钟，并在室温下孵育5分钟。加入200微升氯仿，倒置管混合15次。

将样品在室温下孵育3分钟，然后离心。在不干扰沉淀的情况下，将上清液转移到新鲜的1.5毫升微量离心管中。加入450微升100%乙醇，涡旋试管5秒钟。

然后将700微升样品加载到膜锚定的离心柱上，并离心。丢弃流通液，并加入试剂盒中提供的 700 微升洗涤缓冲液 1。再次离心，丢弃流出物。

用 500 微升洗涤缓冲液 2 重复洗涤以去除痕量盐。加入500微升80%乙醇，离心，并丢弃收集管中的流出物。再次离心离心柱，并将色谱柱转移到新鲜的1.5毫升收集管中。

然后加入14微升无RNase的水，并在室温下孵育5分钟。在室温下以15000倍G再次旋转色谱柱1分钟。准备预混液，并在 8 孔试管中每孔加入 8 微升。

在每个试管中加入12微升提取的总RNA，并在室温下以2000倍G离心管15秒。将试管放入热循环仪中，开始孵育以合成cDNA。孵育后，将cDNA转移到新鲜的微量离心管中。

用蒸馏水将cDNA稀释十倍。然后涡旋，然后在室温下以2000倍G离心5秒。在微量离心管中，按照文本协议中所述制备预混液，并涡旋溶液。

在 96 孔板的每个孔中加入 22.5 微升等分试样，然后加入 2.5 微升 cDNA。使用粘合膜密封板，并以1000倍G离心板30秒，将板放入实时PCR系统中。通过提供实验名称来修改设置。

然后选择96孔0.2毫升作为实验类型，比较CT作为定量方法，标准作为系统运行模式，SYBR Green试剂作为检测目标序列的试剂。提供样品的名称和每个孔中的目标miRNA。分配重复样品，选择参比样品和内源性对照，并选择无染料用作被动参比。

为了消除试剂交叉污染，设置阴性的逆转录酶和miRNA表达的非模板对照。接下来确保反应体积设置为20微升，PCR循环条件设置为95摄氏度15分钟，然后在94摄氏度下变性40次，持续15秒，在55摄氏度下退火30秒，在70摄氏度下延伸30秒。该过程完成后，单击“分析”以分析 qRT-PCR 数据。

确认程序自动选择的阈值线是否适合每个孔。检查每个样品中分析的内源性对照和靶向miRNA的阈值循环值。通过扩增曲线和阈值线的交点确定CT值。

年龄依赖性肾损伤模型的miRNA qRT-PCR数据显示，与SAMR1对照小鼠相比，SAMP1实验小鼠miRNA-7219-5p的肾脏水平显着升高，而miRNA-7218-5p的肾脏水平下降。miRNA-223-3p的表达水平在两种菌株中均未改变。SAMP1小鼠的miRNA-7219-5p和miRNA-7218-5p的血清水平显着增加，而miRNA-223-3p的水平保持不变。

您应该将针头插入下腔静脉并在不穿透血管的情况下提取血液。该方法可用于回答小鼠血清中各种病理状况的microRNA表达谱中的关键问题。