يصف هذا البروتوكول تقنية الرحلان الأكوستوتوفريزي الموائع الدقيقة التي يمكن استخدامها للفصل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام عن الوسط باستخدام الخرز الدقيق المعدل بواسطة aptamer. تمكن أنظمة الرحلان الأيكولومبي الموائع الدقيقة من فصل البكتيريا سالبة الجرام بإنتاجية معقولة وعزل الخلايا غير الملامسة. يمكن تحسين الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة لعزل البكتيريا عن العينات الطبية والبيئية.
للبدء ، قم بتصميم شريحة الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة التي تجمع حبات PS عند المخرج المستهدف وتتخلص من الباقي بعد حقن خليط عينة PS في مدخل العينة. قم بإعداد شريحة مع الطبقات فوق وأسفل طبقة السيليكون المرتبطة بزجاج البورسليكات. وطبقة زجاجية ثالثة من البورسليكات ، باستخدام الأنودة ، تضيف 1000 فولت و 400 درجة مئوية.
قم بتوصيل PZT بطبقة زجاج البورسليكات على طول قناة الموائع الدقيقة باستخدام أقل من 10 ميكرولترات من مادة سيانواكريليت اللاصقة. تطعيم بكتيريا GN و GP في وسط Luria-Bertani واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة. الطرد المركزي للبكتيريا المستزرعة في 9،056 RCF لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم يغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت 1X PBS. قم بإعداد بكتيريا GN و GP المحددة للتحليل عن طريق تعليقها في المخزن المؤقت الملزم. أعد تعليق خليط الخرز الصغير المطلي بالستربتافيدين سعة 10 ميكرومتر قبل الاستخدام.
دوامة الخليط لمدة 20 ثانية. قم بتحضير الأبتامر عن طريق تمسخه عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، ثم إعادة طيه عند صفر درجة مئوية لمدة دقيقتين. انقل 250 ميكرولتر من خليط الخرز الصغير المطلي بالستربتافيدين المعاد تعليقه إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وأضف 100 ميكرولتر من أبتمير الحمض النووي البيوتينيل إلى الأنبوب.
احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران بسرعة 25 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي لخليط التفاعل عند 9،056 RCF لمدة 40 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأنبوب مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-HCl.
أضف 10 ميكرولترات من 100 ملليغرام لكل ملليلتر BSA إلى أنبوب العينة المغسول واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران بسرعة 25 دورة في الدقيقة. أخيرا ، اغسل الخرز الصغير المعدل من aptamer مرتين في المخزن المؤقت Tris-HCl عن طريق الطرد المركزي عند 9،056 RCF لمدة 40 ثانية في درجة حرارة الغرفة. قم بتوصيل أنابيب PEEK بالمدخلين لحقن عينتين ومخزن مؤقت ، والمنفذين لجمع النفايات وتفريغها.
باستخدام حقنة 10 ملليلتر ، املأ قناة الرحلان الأكوستوفوريسيس الموائع الدقيقة بالماء الخالي من الفقاعات. قم بإعداد وحدة تحكم في الضغط الدقيق مع قناتي إخراج أو أكثر للتحكم في تدفق السوائل. بعد تحضير الجهاز، قم بحقن العينة والمخزن المؤقت عن طريق تطبيق ضغط قدره كيلوباسكال على مدخل العينة وأربعة كيلوباسكال على مدخل المخزن المؤقت باستخدام جهاز التحكم الدقيق في الضغط.
باستخدام المجهر ، ركز على حبة وانقلها إلى مركز قناة الموائع الدقيقة باستخدام PZT. توليد تردد رنين يبلغ 3.66 ميغاهرتز باستخدام مولد وظيفة أحادي القناة وتضخيم إشارة نموذجية بمقدار 16 ديسيبل باستخدام مضخم طاقة. راقب عمليات الفصل والإثراء على رقاقة الموائع الصوتية باستخدام مجهر فلوري وكاميرا عالية السرعة تعمل بسرعة 1،200 إطار في الثانية.
أكدت الشريحة الصوتية التي تم تقديمها في هذه الدراسة أنه مع زيادة جهد PZT ، زاد التركيز المركزي للخرز بحجم 10 ميكرومتر. عند خمسة فولت من جهد PZT ، تركزت معظم الخرز بحجم 10 ميكرومتر في المركز. يشار إلى نسبة عدد الخرز الذي تم جمعه في المخرج إلى العدد الإجمالي للخرز المحقون بحجم 10 ميكرومتر باسم معدل الاسترداد.
يشار إلى نسبة عدد الخرز بحجم 10 ميكرومتر إلى إجمالي عدد الخرز الذي تم جمعه باسم النقاء. أشارت النتائج إلى أن الجهاز يتمتع بكفاءة فصل عالية للخرز بحجم 10 ميكرومترات. تم قياس أعداد بكتيريا GN و GP المرتبطة بكل حبة صغيرة معدلة من aptamer باستخدام مجهر مزود بكاميرا عالية السرعة.
كانت جميع بكتيريا GN الخمسة مرتبطة بالخرز بينما كان عدد أقل بكثير من بكتيريا GP مرتبطا بالمواد التي تم اختبارها. اختلفت قوة الإشارة اختلافا كبيرا بين بكتيريا GN و GP. يجب استخدام المادة اللاصقة المستخدمة لإرفاق PZT بأقل قدر ممكن من الدقة للتموج ويجب أن تكون PZT والقناة الدقيقة متوازية.
يمكن استخدام هذا الجهاز للكشف عن البكتيريا الحية أو المؤشرات الحيوية المشتقة من البكتيريا في فترة التشخيص المبكر للأمراض المعدية البكتيرية.
