Bu protokol, aptamer modifiye mikro boncuklar kullanılarak Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde ayrılması için kullanılabilecek mikroakışkan akustoforez teknolojimizi açıklamaktadır. Mikroakışkan akustoforez sistemleri, makul verim ve temassız hücre izolasyonu ile Gram-negatif bakteri ayrımını sağlar. Mikroakışkan akustoforez, bakterileri tıbbi ve çevresel örneklerden izole etmek için optimize edilebilir.
Başlamak için, hedef çıkışta PS boncuklarını toplayan ve numune girişine bir PS numune karışımı enjekte ettikten sonra geri kalanını atan mikroakışkan bir akustoforez çipi tasarlayın. Borosilikat camına bağlanmış silikon tabakanın üstündeki ve altındaki katmanlarla bir çip hazırlayın. Ve eloksal kullanarak üçüncü bir borosilikat cam tabakası 1000 volt ve 400 santigrat derece ekler.
10 mikrolitreden az siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak mikroakışkan kanal boyunca borosilikat cam tabakaya bir PZT takın. GN ve GP bakterilerini Luria-Bertani ortamında aşılayın ve 16 saat boyunca dakikada 37 santigrat derece ve 220 devirde inkübe edin. Kültürlenmiş bakterileri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 9.056 RCF'de santrifüj edin.
Ardından 1X PBS tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen GN ve GP bakterilerini bağlanma tamponunda yeniden askıya alarak analiz için hazırlayın. 10 mikrometre streptavidin kaplı mikro boncuk karışımını kullanmadan önce tekrar askıya alın.
Karışımı 20 saniye boyunca vorteksleyin. Aptamer'i üç dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre ederek ve ardından iki dakika boyunca sıfır santigrat derecede yeniden katlayarak hazırlayın. Yeniden askıya alınmış streptavidin kaplı mikro boncuk karışımının 250 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpe 100 mikrolitre biyotinile DNA aptamer ekleyin.
Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ederken dakikada 25 devirde döndürün. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 40 saniye boyunca 9.056 RCF'de santrifüj edin. Daha sonra tüpü 200 mikrolitre Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkayın.
Yıkanmış numune tüpüne mililitre BSA başına 10 mikrolitre 100 miligram ekleyin ve dakikada 25 devirde dönerken oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, aptamer modifiye mikro boncukları Tris-HCl tamponunda iki kez 9.056 RCF'de santrifüjleme ile oda sıcaklığında 40 saniye yıkayın. PEEK tüplerini iki numune ve tampon enjekte etmek için iki girişe ve atıkları toplamak ve boşaltmak için iki çıkışa bağlayın.
10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, mikroakışkan aküstoforez kanalını kabarcıksız demineralize su ile doldurun. Sıvı akışını kontrol etmek için iki veya daha fazla çıkış kanalına sahip hassas bir basınç kontrolörü hazırlayın. Cihazı hazırladıktan sonra, hassas basınç kontrol cihazını kullanarak numune girişine iki kilopaskal ve tampon girişine dört kilopaskal basınç uygulayarak numuneyi ve tamponu enjekte edin.
Bir mikroskop kullanarak, bir boncuk üzerine odaklanın ve PZT'yi kullanarak mikroakışkan kanalın merkezine taşıyın. Tek kanallı bir fonksiyon üreteci kullanarak 3.66 megahertz'lik bir rezonans frekansı oluşturun ve bir güç amplifikatörü kullanarak tipik bir sinyali 16 desibel yükseltin. Bir floresan mikroskobu ve saniyede 1.200 kare hızında çalışan yüksek hızlı bir kamera ile akustoakışkan çip üzerindeki ayırma ve zenginleştirme işlemlerini gözlemleyin.
Bu çalışmada tanıtılan akustophoretic çip, PZT'nin voltajı arttıkça, 10 mikrometre büyüklüğündeki boncukların merkezi konsantrasyonunun arttığını doğruladı. PZT voltajının beş voltunda, 10 mikrometre büyüklüğündeki boncukların çoğu merkezde yoğunlaşmıştı. Çıkışta toplanan boncuk sayısının enjekte edilen toplam 10 mikrometre büyüklüğündeki boncuk sayısına oranı, geri kazanım oranı olarak adlandırıldı.
10 mikrometre büyüklüğündeki boncuk sayısının toplanan toplam boncuk sayısına oranı saflık olarak adlandırıldı. Sonuçlar, cihazın 10 mikrometre boyutundaki boncuklar için yüksek bir ayırma verimliliğine sahip olduğunu gösterdi. Her aptamer modifiye mikro boncuğuna bağlı GN ve GP bakterilerinin sayısı, yüksek hızlı kameralı bir mikroskop kullanılarak ölçüldü.
Beş GN bakterisinin tümü boncuklara bağlanırken, test edilen maddelere önemli ölçüde daha az GP bakterisi bağlandı. Sinyal gücü, GN ve GP bakterileri arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi. PZT'yi tutturmak için kullanılan yapıştırıcı, oluklu mukavvanın doğruluğu için mümkün olduğunca az kullanılmalı ve PZT ve mikrokanal paralel olmalıdır.
Bu cihaz, bakteriyel bulaşıcı hastalıkların erken tanı döneminde canlı bakterileri veya bakteri kaynaklı biyobelirteçleri tespit etmek için kullanılabilir.
