Этот протокол описывает нашу технологию микрофлюидного акустофореза, которая может быть использована для быстрого и эффективного отделения грамотрицательных бактерий от среды с использованием модифицированных аптамерами микрошариков. Системы микрофлюидного акустофореза позволяют разделять грамотрицательные бактерии с разумной пропускной способностью и бесконтактной изоляцией клеток. Микрофлюидный акустофорез может быть оптимизирован для выделения бактерий из медицинских образцов и образцов окружающей среды.
Для начала разработайте микрофлюидный чип акустофореза, который собирает ШАРИКИ PS на целевом выходе и отбрасывает остальные после введения смеси образца PS во входное отверстие образца. Подготовьте чип со слоями выше и ниже слоя кремния, связанными с боросиликатным стеклом. А третий слой боросиликатного стекла, используя анодирование, добавляют 1000 вольт и 400 градусов Цельсия.
Прикрепите PZT к боросиликатному стеклянному слою вдоль микрофлюидного канала, используя менее 10 микролитров цианоакрилатного клея. Инокулируют бактерии GN и GP в среде Лурия-Бертани и инкубируют ее при 37 градусах Цельсия и 220 оборотах в минуту в течение 16 часов. Центрифугируйте культивируемые бактерии при 9 056 RCF в течение одной минуты при комнатной температуре.
Затем дважды промыть буфером 1X PBS. Подготовьте выбранные бактерии GN и GP к анализу, повторно разместив их в буфере связывания. Перед использованием повторно используйте 10-микрометровую смесь микрошариков со стрептавидиновым покрытием.
Вращайте смесь в течение 20 секунд. Приготовьте аптамер, денатурируя его при 95 градусах Цельсия в течение трех минут, а затем повторно складывая его при нуле градусов Цельсия в течение двух минут. Переложите 250 микролитров повторно суспендированной смеси микрошариков с покрытием стрептавидин в трубку объемом 1,5 миллилитра и добавьте в трубку 100 микролитров биотинилированного аптамера ДНК.
Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут, вращая со скоростью 25 оборотов в минуту. Центрифугируют реакционную смесь при 9, 056 RCF в течение 40 секунд при комнатной температуре. Затем дважды промыть трубку 200 микролитрами буфера Tris-HCl.
Добавьте 10 микролитров по 100 миллиграммов на миллилитр BSA в промытую пробочку и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, вращаясь со скоростью 25 оборотов в минуту. Наконец, дважды промывайте модифицированные аптамером микрошарики в буфере Tris-HCl центрифугированием при 9 056 RCF в течение 40 секунд при комнатной температуре. Подключите трубки PEEK к двум входным отверстиям для впрыска двух образцов и буфера, а также к двум выходам для сбора и сброса отходов.
Используя шприц объемом 10 миллилитров, заполните канал микрофлюидного акустофореза безпузырьковой деминерализованной водой. Подготовьте прецизионный регулятор давления с двумя или более выходными каналами для управления потоком жидкости. После подготовки устройства вводят образец и буфер, применяя давление двух килопаскалей к входу образца и четырех килопаскалей к буферному входу с помощью прецизионного устройства контроля давления.
С помощью микроскопа сосредоточьтесь на шарике и переместите его к центру микрофлюидного канала с помощью PZT. Генерируйте резонансную частоту 3,66 мегагерца с помощью генератора одноканальной функции и усиливайте типичный сигнал на 16 децибел с помощью усилителя мощности. Наблюдайте за процессами разделения и обогащения на акустофлюидном чипе с помощью флуоресцентного микроскопа и высокоскоростной камеры, работающей со скоростью 1 200 кадров в секунду.
Акустофоретический чип, представленный в этом исследовании, подтвердил, что по мере увеличения напряжения PZT центральная концентрация бусин размером 10 микрометров увеличивалась. При пяти вольтах напряжения PZT большая часть шариков размером 10 микрометров была сосредоточена в центре. Отношение количества бусин, собранных на выходе, к общему количеству введенных бусин размером 10 микрометров называлось скоростью восстановления.
Отношение количества бусин размером 10 микрометров к общему количеству собранных бусин называлось чистотой. Результаты показали, что устройство имело высокую эффективность разделения для бусин размером 10 микрометров. Количество бактерий GN и GP, связанных с каждой модифицированной микрошарикой аптамера, измерялось с помощью микроскопа с высокоскоростной камерой.
Все пять бактерий GN были связаны с шариками, в то время как значительно меньше бактерий GP были связаны с тестируемыми веществами. Сила сигнала значительно различалась между бактериями GN и GP. Клей, используемый для крепления PZT, должен использоваться как можно меньше для точности гофрирования, а PZT и микроканал должны быть параллельными.
Этот прибор может быть использован для обнаружения живых бактерий или биомаркеров бактерий, полученных в период ранней диагностики бактериальных инфекционных заболеваний.
