Este protocolo describe nuestra tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Los sistemas de acustoforesis microfluídica permiten la separación de bacterias gramnegativas con un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto. La acustoforesis microfluídica se puede optimizar para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales.
Para comenzar, diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que recolecte perlas de PS en la salida objetivo y descarte el resto después de inyectar una mezcla de muestra de PS en la entrada de muestra. Prepare un chip con las capas por encima y por debajo de la capa de silicio unidas al vidrio de borosilicato. Y una tercera capa de vidrio de borosilicato, usando anodización, agrega 1000 voltios y 400 grados centígrados.
Fije un PZT a la capa de vidrio de borosilicato a lo largo del canal microfluídico utilizando menos de 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato. Inocular las bacterias GN y GP en medio Luria-Bertani e incubarlo a 37 grados centígrados y 220 revoluciones por minuto durante 16 horas. Centrifugar las bacterias cultivadas a 9, 056 RCF durante un minuto a temperatura ambiente.
Luego lavar dos veces con 1X PBS buffer. Prepare las bacterias GN y GP seleccionadas para el análisis resuspendiéndolas en el tampón de unión. Vuelva a suspender la mezcla de microperlas recubierta de estreptavidina de 10 micrómetros antes de usarla.
Vortex la mezcla durante 20 segundos. Prepare el aptámero desnaturalizándolo a 95 grados centígrados durante tres minutos, y luego volviéndolo a doblar a cero grados centígrados durante dos minutos. Transfiera 250 microlitros de la mezcla de microperlas recubierta de estreptavidina resuspendida a un tubo de 1.5 mililitros y agregue 100 microlitros de aptámero de ADN biotinilado al tubo.
Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira a 25 revoluciones por minuto. Centrifugar la mezcla de reacción a 9, 056 RCF durante 40 segundos a temperatura ambiente. Luego lave el tubo dos veces con 200 microlitros de tampón Tris-HCl.
Agregue 10 microlitros de 100 miligramos por mililitro BSA al tubo de muestra lavado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras gira a 25 revoluciones por minuto. Finalmente, lave las microperlas modificadas con aptámero dos veces en tampón Tris-HCl por centrifugación a 9, 056 RCF durante 40 segundos a temperatura ambiente. Conecte los tubos de PEEK a las dos entradas para inyectar dos muestras y tampón, y las dos salidas para recoger y descargar los residuos.
Con una jeringa de 10 mililitros, llene el canal de acustoforesis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas. Prepare un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida para controlar el flujo de fluido. Después de preparar el dispositivo, inyecte la muestra y el tampón aplicando una presión de dos kilopascales a la entrada de la muestra y cuatro kilopascales a la entrada del tampón utilizando el dispositivo de control de presión de precisión.
Usando un microscopio, enfóquese en una cuenta y muévala al centro del canal microfluídico usando el PZT. Genere una frecuencia de resonancia de 3,66 megahercios utilizando un generador de funciones de un solo canal y amplifique una señal típica en 16 decibelios utilizando un amplificador de potencia. Observe los procesos de separación y enriquecimiento en el chip acustofluídico con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta velocidad que funciona a 1.200 fotogramas por segundo.
El chip acústoforético introducido en este estudio confirmó que, a medida que aumentaba el voltaje del PZT, aumentaba la concentración central de las perlas de 10 micrómetros. A cinco voltios del voltaje PZT, la mayoría de las perlas de 10 micrómetros se concentraron en el centro. La relación entre el número de perlas recogidas en la salida y el número total de perlas inyectadas de 10 micrómetros se denominó tasa de recuperación.
La relación entre el número de cuentas de 10 micrómetros y el número total de cuentas recolectadas se denominó pureza. Los resultados indicaron que el dispositivo tenía una alta eficiencia de separación para perlas con un tamaño de 10 micrómetros. El número de bacterias GN y GP unidas a cada microperla modificada con aptámero se midió utilizando un microscopio con una cámara de alta velocidad.
Las cinco bacterias GN se unieron a las perlas, mientras que significativamente menos bacterias GP se unieron a las sustancias probadas. La intensidad de la señal difirió significativamente entre las bacterias GN y GP. El adhesivo utilizado para fijar el PZT debe usarse lo menos posible para la precisión de la corrugación y el PZT y el microcanal deben ser paralelos.
Este dispositivo se puede utilizar para detectar bacterias vivas o biomarcadores derivados de bacterias en el período de diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas.
