이 프로토콜은 압타머 변형 마이크로 비드를 사용하여 배지에서 그람 음성 박테리아를 빠르고 효율적으로 분리하는 데 사용할 수 있는 당사의 미세유체 음향 영동 기술을 설명합니다. 미세유체 음향 제거 시스템은 합리적인 처리량과 비접촉 세포 분리로 그람 음성 박테리아 분리를 가능하게 합니다. 미세유체 음향영동은 의료 및 환경 샘플에서 박테리아를 분리하도록 최적화할 수 있습니다.
시작하려면 대상 출구에서 PS 비드를 수집하고 PS 샘플 혼합물을 샘플 입구에 주입한 후 나머지를 버리는 미세 유체 음향 영동 칩을 설계합니다. 붕규산 유리에 결합 된 실리콘 층 위와 아래의 층이있는 칩을 준비하십시오. 그리고 세 번째 붕규산 유리 층은 양극 산화 처리를 사용하여 1000볼트와 섭씨 400도를 추가합니다.
PZT를 10 마이크로리터 미만의 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 마이크로유체 채널을 따라 붕규산 유리층에 부착한다. GN 및 GP 박테리아를 Luria-Bertani 배지에 접종하고 섭씨 37도 및 분당 220 회전으로 16 시간 동안 배양합니다. 배양된 박테리아를 9, 056 RCF에서 실온에서 1분 동안 원심분리한다.
그런 다음 1X PBS 버퍼로 두 번 세척하십시오. 선택된 GN 및 GP 박테리아를 결합 완충액에 재현탁시켜 분석을 위해 준비합니다. 사용하기 전에 10마이크로미터 스트렙타비딘 코팅된 마이크로 비드 혼합물을 재현탁합니다.
혼합물을 20 초 동안 와류시킨다. 압타머를 섭씨 95도에서 3분 동안 변성시킨 다음 섭씨 0도에서 2분 동안 다시 접어서 압타머를 준비합니다. 재현탁된 스트렙타비딘 코팅된 마이크로비드 혼합물 250마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 100마이크로리터의 비오틴화 DNA 앱타머를 튜브에 추가합니다.
혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하면서 분당 25회전으로 회전시킨다. 반응 혼합물을 실온에서 40초 동안 9, 056 RCF에서 원심분리한다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 Tris-HCl 버퍼로 튜브를 두 번 세척하십시오.
세척된 샘플 튜브에 밀리리터 BSA당 100밀리그램 10마이크로리터를 추가하고 분당 25회전으로 회전하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 압타머 변성 마이크로비드를 Tris-HCl 완충액에 2회 세척하여 9, 056 RCF에서 실온에서 40초 동안 원심분리하였다. PEEK 튜브를 두 개의 샘플과 버퍼를 주입하기위한 두 개의 입구와 폐기물 수집 및 배출을위한 두 개의 배출구에 연결합니다.
10 밀리리터 주사기를 사용하여 미세 유체 음향 영동 채널을 기포가없는 탈염수로 채 웁니다. 유체 흐름을 제어하기 위해 두 개 이상의 출력 채널이 있는 정밀 압력 컨트롤러를 준비합니다. 장치를 준비한 후 정밀 압력 제어 장치를 사용하여 시료 입구에 2킬로파스칼, 버퍼 입구에 4킬로파스칼의 압력을 가하여 시료와 버퍼를 주입합니다.
현미경을 사용하여 비드에 초점을 맞추고 PZT를 사용하여 미세유체 채널의 중심으로 이동합니다. 단일 채널 함수 발생기를 사용하여 3.66메가헤르츠의 공진 주파수를 생성하고 전력 증폭기를 사용하여 일반 신호를 16데시벨로 증폭합니다. 형광 현미경과 초당 1, 200 프레임으로 작동하는 고속 카메라로 음향 유체 칩의 분리 및 농축 과정을 관찰하십시오.
본 연구에서 도입된 음향영동 칩은 PZT의 전압이 증가함에 따라 10마이크로미터 크기의 비드의 중심 농도가 증가하는 것을 확인하였다. PZT 전압의 5 볼트에서 10 마이크로 미터 크기의 비드 대부분이 중앙에 집중되었습니다. 주입된 10 마이크로미터 크기의 비드의 총 수에 대한 출구에서 수집된 비드의 수의 비율을 회수율이라고 불렀다.
수집된 비드의 총 수에 대한 10 마이크로미터 크기의 비드의 수의 비율을 순도라고 불렀다. 결과는 장치가 10 마이크로 미터 크기의 비드에 대해 높은 분리 효율을 가짐을 나타냅니다. 각 앱타머 변형 마이크로 비드에 결합된 GN 및 GP 박테리아의 수를 고속 카메라를 갖춘 현미경을 사용하여 측정하였다.
5 개의 GN 박테리아가 모두 비드에 결합 된 반면 테스트 된 물질에 결합 된 GP 박테리아는 현저히 적었습니다. 신호 강도는 GN과 GP 박테리아간에 유의하게 달랐다. PZT를 부착하는 데 사용되는 접착제는 주름의 정확성을 위해 가능한 한 적게 사용해야하며 PZT와 마이크로 채널은 평행해야합니다.
이 장치는 세균성 전염병의 조기 진단 기간에 살아있는 박테리아 또는 박테리아 유래 바이오 마커를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
