تصف هذه الكلمة تحليل التنفس في معالجة الميتوكوندريا من العضلات الهيكلية للفأر. يقلل هذا البروتوكول بشكل كبير من وقت التنقية ويسمح بمعالجة عينات متعددة في وقت واحد. يمكن تشويه الميتوكوندريا من الحيوانات في أي ثمانية أجناس من خلفية يونايتد باستخدام هذا البروتوكول مما يتيح دراسة التنفس في مجموعة واسعة من الظروف التجريبية.
هذه الطريقة مناسبة لجميع مجالات البحث التي تكون فيها وظيفة الميتوكوندريا ذات صلة بما في ذلك الشيخوخة أو اختبار المخدرات أو السرطان أو التطور. يمكن حتى تكييفها مع الأنسجة والكائنات الحية الأخرى أيضا. تأكد من أن جميع المواد باردة عن طريق وضع كل شيء على الجليد أثناء الإجراء لحماية الميتوكوندريا من التلف.
ضع ثلاثة أكواب 50 ملليلتر لكل عينة على الجليد وأضف 10 ملليلتر من PBS في كوب واحد ، و 10 ملليلتر من 10 ملليمولار EDTA PBS في دورق اثنين ، وأربعة ملليلتر IB1 في دورق ثلاثة. رش الطرف الخلفي الأيمن للفأر الرحيم بالإيثانول بنسبة 70٪ لمنع الفراء من التساقط وربط الطرف بلوحة تشريح الفلين ثم ربط الطرف الأمامي الأيسر. قم بعمل شق باستخدام مشرط معقم يمكن التخلص منه عبر الجلد من الركبة إلى أخمص القدمين.
أمسك الجلد بملقط مسنن على مستوى الكاحل وقطعه بمقص ناعم حول الكاحل. خفف الجلد بعيدا عن العضلات الأساسية باستخدام ملاقط دقيقة في يد واحدة أثناء سحبه باستخدام ملقط مسنن في اليد الأخرى. تشريح جميع عضلات الهيكل العظمي من الكاحل إلى الركبة وإزالة جميع الأنسجة الضامة فوق العضلة الأمامية الظنبوبية باستخدام ملاقط ومقص دقيق.
أوجد الأوتار الأربعة البعيدة للعضلة الباسطة الرقمية الطويلة وقسمها بالقرب من إدخالاتها في أصابع القدم. حدد موقع الوتر البعيد الأمامي الظنبوبي وقطعه بالقرب من إدخاله أسفل الكاحل. اسحب أوتار الظنبوب الأمامية والباسطة الرقمية الطويلة فوق الكاحل لتحرير الأطراف الرخوة.
أمسك بالأطراف الرخوة للأوتار وقم بتخفيف العضلات بعيدا عن بقية العضلات في العظام عن طريق سحبها لأعلى. قطع الأوتار القريبة من هذه العضلات أقرب ما يمكن إلى الرضفة. اقلب الماوس رأسا على عقب للمضي قدما في استخراج العضلات المعدية والوحيدة.
أمسك الجيب المتشكل بين العضلة ذات الرأسين وعظم الفخذ والمعدة وافصل هذه العضلات باستخدام مقص دقيق لتصور وتر المعدة القريب. قبضة وقطع بعناية وتر أخيل البعيد مع مقص غرامة. قطع وتر المعدة القريبة لتحريره مع النعل الأساسي.
تشريح العضلات المتبقية بعناية وإعادة تثبيت الماوس في الموضع الأولي لتشريح عضلة الفخذ الرباعية. تخلص من الأنسجة الدهنية ثم أدخل ملاقط دقيقة بين الفخذ الرباعي وعظم الفخذ لفصل العضلات عن العظام. أمسك بأوتار العضلات رباعية الرؤوس البعيدة واقطع الوتر في أقرب مكان ممكن من الرضفة.
اسحب العضلة رباعية الرؤوس لأعلى وحررها بمقص دقيق عند الإدخال القريب. كرر الشيء نفسه للطرف الخلفي الأيسر. شطف جميع العضلات في دورق واحد ، ثم اثنين ، تليها دورق ثلاثة.
أخيرا ، قم بفرم جميع العضلات في الكأس الثالثة بمقص حاد على الجليد. انقل التعليق إلى أنبوب C ، وأغلقه بإحكام ، وقم بإرفاقه رأسا على عقب على غلاف المجانس. قسم المتجانس إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي الصغيرة المبردة مسبقا سعة 2 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق.
ثم انقل المادة الفائقة إلى أنابيب جديدة مبردة مسبقا وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق أخرى. الجمع بين بيليه في 500 ميكرولتر من IB2 نقل supernatant إلى أنبوب جديد 2 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا وتسميته على أنه supernatant رقم اثنين ، أو SN2. أعد تعليق حبيبة الميتوكوندريا النهائية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق.
ضع جانبا بسرعة 10 ميكرولترات لتحديد كمية البروتين وأضف على الفور 10 ميكرولترات من 10٪ FFA BSA إلى تعليق الميتوكوندريا المتبقي لمنع الضرر. الطرد المركزي لتعليق الميتوكوندريا المركز عند 10،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق بيليه الميتوكوندريا في 100 ميكرولتر من متوسط فحص اقتران 1X مع BSA ، أو وسط فحص تدفق الإلكترون 1X مع BSA ، أو وسط أكسدة بيتا 1X مع BSA ، اعتمادا على البروتوكول الذي سيتم إجراؤه.
قم بتخفيف عينة الميتوكوندريا المركزة هذه إلى 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر باستخدام وسط الفحص المقابل. زرع 50 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في صفيحة صغيرة من 24 بئرا مبردة مسبقا على الجليد. في آبار تصحيح الخلفية ، أضف وسيط الفحص المقابل فقط.
قم بتخزين تعليق الميتوكوندريا المتبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحديد نقاء التجزئة. قم بتدوير اللوحة الصغيرة في جهاز الطرد المركزي التحضيري المبرد مسبقا لمدة 20 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بتسخين الفحص المتبقي متوسط إلى 37 درجة مئوية.
بعد الطرد المركزي ، اترك اللوحة الصغيرة على المقعد لمدة خمس دقائق لتحقيق التوازن. أضف 450 ميكرولتر من وسط الفحص الدافئ لكل بئر ببطء وبعناية لتجنب فصل الميتوكوندريا. ضع اللوحة الدقيقة على الفور في أداة قياس استهلاك الأكسجين بدون الغطاء وابدأ برنامج القياس.
تأكد من أن الخطوة الأولى هي حضانة لمدة 10 دقائق للسماح للصفيحة الصغيرة بالإحماء. بمجرد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة الخرطوشة واللوحة الدقيقة ، وقم بإيقاف تشغيل الجهاز ، وابدأ التحليل. أظهرت ملامح البروتين العامة من الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها من خلال أجهزة الطرد المركزي التسلسلية مجموعات بروتين متميزة في الكسور المعزولة.
يتضح وجود كل محتوى الميتوكوندريا من خلال الإشارات القوية لعلامات غشاء الميتوكوندريا الخارجي والداخلي والبروتينات المرتبطة بالنيوكليويد. يمثل الكسر N النوى والمواد غير المعطلة. معظم الشبكة الإندوبلازمية أو الغشاء البلازمي أو علامات السيتوبلازم في كسور SN1 أو SN2 تسلط الضوء على النقاء العالي الذي تم الحصول عليه أثناء العزلة.
لوحظت زيادة في استهلاك الأكسجين بعد إضافة ADP في مقايسات الاقتران وأكسدة بيتا. بعد إضافة الكربونيل سيانيد - ف - ثلاثي فلورو ميثوكسي فينيل هيدرازون ، وصل استهلاك الأكسجين إلى أعلى مستوى له. تضمن نسبة التحكم في الجهاز التنفسي المنخفضة سلامة الميتوكوندريا المعزولة.
فحص فحص تدفق الإلكترون نشاط مجمعات سلسلة نقل الإلكترون بشكل فردي أو مجتمعة من خلال حقن ركائز ومثبطات محددة. عزل الميتوكوندريا حساسة للغاية. وبالتالي يجب تنفيذ جميع الخطوات بعد تخفيف الأنسجة بجد وبعناية للحفاظ على صلاحيتها.
يمكن استكمال الفحوصات التجريبية بتحليل سيماتي حتمي لجزيئات الميتوكوندريا الرئيسية أو بدراسة تجميع مجمعات التنفس باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام البولي أكريلاميد الأصلي الأزرق.
