Ce mot décrit l’analyse de la respiration dans le traitement des mitochondries du muscle squelettique de la souris. Ce protocole réduit considérablement le temps de purification et permet de traiter plusieurs échantillons simultanément. Les mitochondries d’animaux de n’importe quel sexe d’origine unie peuvent être mutilées à l’aide de ce protocole permettant l’étude de la respiration dans une grande variété de conditions expérimentales.
Cette méthode convient à tous les domaines de recherche où la fonction des mitochondries est pertinente, y compris le vieillissement, le dépistage de médicaments, le cancer ou le développement. Il peut même être adapté à d’autres tissus et organismes. Assurez-vous que tous les matériaux sont froids en plaçant tout sur la glace pendant la procédure pour protéger les mitochondries des dommages.
Placez trois béchers de 50 millilitres par échantillon sur de la glace et ajoutez 10 millilitres de PBS dans un bécher, 10 millilitres de 10 millilitres EDTA PBS dans le bécher deux et quatre millilitres IB1 dans le bécher trois. Vaporisez le membre postérieur droit d’une souris euthanasiée avec 70% d’éthanol pour empêcher la fourrure de perdre et collez le membre sur la planche de dissection en liège, puis collez le membre avant gauche. Faites une incision avec un scalpel jetable stérile à travers la peau du genou aux orteils.
Saisissez la peau avec une pince dentée au niveau de la cheville et coupez-la avec de fins ciseaux autour de la cheville. Éloignez la peau de la musculature sous-jacente avec une pince à épiler fine dans une main tout en la tirant vers le haut avec des pinces dentées dans l’autre main. Disséquez tous les muscles squelettiques de la cheville au genou et retirez tout le tissu conjonctif sur le muscle antérieur du tibialis à l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux.
Trouvez les quatre tendons distaux du muscle extenseur digitorum longus et coupez-les près de leurs insertions dans les orteils. Localisez le tendon distal antérieur tibialis et coupez-le près de son insertion sous la cheville. Tirez les tendons tibialis antérieur et extenseur digitorum longus au-dessus de la cheville pour libérer les extrémités lâches.
Saisissez les extrémités lâches des tendons et éloignez les muscles du reste de la musculature dans les os en les tirant vers le haut. Coupez les tendons proximaux de ces muscles le plus près possible de la rotule. Tournez la souris à l’envers pour procéder à l’extraction musculaire gastrocnémienne et soléaire.
Saisissez la poche formée entre les biceps, les fémoris et le gastrocnémien et séparez ces muscles à l’aide de ciseaux fins pour visualiser le tendon gastrocnémien proximal. Saisissez et coupez soigneusement le tendon d’Achille distal avec de fins ciseaux. Coupez le tendon gastrocnémien proximal en le libérant avec le soléaire sous-jacent.
Disséquez soigneusement les muscles restants et épinglez à nouveau la souris dans la position initiale pour disséquer le muscle quadriceps. Jetez le tissu adipeux puis insérez une pince à épiler fine entre le quadriceps et le fémur pour séparer le muscle de l’os. Saisissez les tendons musculaires du quadriceps distal et coupez le tendon le plus près possible de la rotule.
Tirez les quadriceps vers le haut et libérez-les avec de fins ciseaux à l’insertion proximale. Répétez la même chose pour le membre postérieur gauche. Rincez tous les muscles dans le bécher un, puis deux, suivi du bécher trois.
Enfin, hachez tous les muscles dans le bécher trois avec des ciseaux tranchants sur la glace. Transférez la suspension dans un tube C, fermez-la hermétiquement et fixez-la à l’envers sur le manchon de l’homogénéisateur. Diviser l’homogénat en deux tubes de microcentrifugation pré-refroidis de 2 millilitres et centrifuger pendant 10 minutes.
Ensuite, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes pré-réfrigérés et centrifugez pendant encore 10 minutes. Combinez la pastille dans 500 microlitres d’IB2 Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidis de 2 millilitres et étiquetez-le comme surnageant numéro deux, ou SN2. Re suspendre la pastille mitochondriale finale dans 200 microlitres de tampon de ressis.
Mettez rapidement de côté 10 microlitres pour la quantification des protéines et ajoutez immédiatement 10 microlitres de 10% de BSA FFA à la suspension mitochondriale restante pour éviter tout dommage. Centrifuger la suspension mitochondriale concentrée à 10 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Re suspendre la pastille mitochondriale dans 100 microlitres de milieu d’essai de couplage 1X avec BSA, 1X milieu de test de flux d’électrons avec BSA, ou 1X milieu d’oxydation bêta avec BSA, selon le protocole à effectuer.
Diluer cet échantillon mitochondrial concentré à 0,2 microgramme par microlitre en utilisant le milieu d’essai correspondant. Ensemencez 50 microlitres de la suspension par puits dans une microplaque pré-réfrigérée de 24 puits sur glace. Dans les puits de correction de fond, ajoutez uniquement le milieu d’essai correspondant.
Conservez la suspension mitochondriale restante à moins 80 degrés Celsius pour la détermination de la pureté de la fragmentation. Faire tourner la microplaque dans la centrifugeuse préparative pré-réfrigérée pendant 20 minutes. En attendant, réchauffez le milieu d’essai restant à 37 degrés Celsius.
Après centrifugation, laissez la microplaque sur le banc pendant cinq minutes pour équilibrer. Ajouter 450 microlitres du milieu d’essai chaud par puits lentement et soigneusement pour éviter le détachement des mitochondries. Placez la microplaque immédiatement dans l’instrument de mesure de la consommation d’oxygène sans le couvercle et démarrez le programme de mesure.
Assurez-vous que la première étape est une incubation de 10 minutes pour permettre à la microplaque de se réchauffer. Une fois l’expérience terminée, retirez la cartouche et la microplaque, éteignez l’instrument et commencez l’analyse. Les profils protéiques généraux des différentes fractions obtenues par centrifugations en série ont montré des populations protéiques distinctes dans les fractions isolées.
La présence de tout le contenu mitochondrial est évidente par les signaux forts pour les marqueurs de la membrane mitochondriale externe et interne et des protéines associées aux nucléoïdes. La fraction N représente les noyaux et le matériau non perturbé. La plupart des marqueurs du réticulum endoplasmique, de la membrane plasmique ou du cytoplasme dans les fractions SN1 ou SN2 mettent en évidence la grande pureté obtenue lors de l’isolement.
Une augmentation de la consommation d’oxygène a été observée après l’ajout d’ADP dans les essais de couplage et d’oxydation bêta. Après l’ajout de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxy phénylhydrazone, la consommation d’oxygène a atteint son plus haut niveau. Un faible rapport de contrôle respiratoire assure l’intégrité des mitochondries isolées.
Le test de flux d’électrons a examiné l’activité des complexes de chaîne de transport d’électrons individuellement ou en combinaison par l’injection de substrats et d’inhibiteurs spécifiques. Les mitochondries isolantes sont extrêmement sensibles. Par conséquent, toutes les étapes après l’atténuation des tissus doivent être effectuées avec diligence et soin pour préserver leur viabilité.
Les essais expérimentaux peuvent être complétés par une analyse sématique déterministe des molécules clés des mitochondries ou par l’étude de l’assemblage de complexes respirométriques à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu.
