وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY12998) لاندرادي FH.

1. إعداد المخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على 5804R الطرد المركزي وتعيين إلى 4 درجات مئوية. بدوره على حمام ماء Isotemp 3006D وتعيين إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية قبل العزلة العضلات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS : ذوب الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أقراص في الماء المقطر (5 أقراص / لتر). مزيج جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج تلفزيوني بالاضافة الى 10 ملي EDTA : لإعداد حل 100 مل ، إضافة 2 مل من EDTA ملي 500-98 مليلتر من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الميتوكوندريا العازلة 8X : 10.28 غرام من السكروز عن تركيز النهائي من 0.6 متر ، 400 ملغ من الأحماض الدهنية الحرة ألبومين المصل البقري (BSA) لتركيز النهائي من 0.8 ٪ ، 2،08 غرام من HEPES لتركيز النهائي من 160 مم ، ودرجة الحموضة وإلى 7.4 QS إلى 50 مل بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتياطي العزلة 1 (IB1) : أضف 200 ميكرولتر من EDTA 500 مم لتركيز النهائي من 10 مم ، 0.392 غرام من مد مانيتول لتركيز النهائي من 215 مم ، 1.25 مل من 8X الميتوكوندريا درجة الحموضة ، وإلى 7.4 العازلة QS إلى 10 مل من الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتياطي العزلة 2 (IB2) : أضف 60 ميكرولتر من EGTA 500 مم لتركيز النهائي من 3 مم ، 0.392 غرام من مد مانيتول لتركيز النهائي من 215 مم ، 1.25 مل من 8X الميتوكوندريا درجة الحموضة ، وإلى 7.4 العازلة QS إلى 10 مل من الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتياطي التجريبية (EB) : أضف 100 ميكرولتر من 500 مم 2 للMgCl تركيز النهائي من 5 ملم ، 0.392 غرام من مد مانيتول لتركيز النهائي من 215 ملم ، 25 ميكرولتر من 2.5 ملي KH 2 PO 4 لتركيز النهائي 6.25 ميكرومتر ، 2 ميكرولتر من EGTA 100 ملم لتركيز النهائي من 20 ميكرون ، 1.25 مل من الميتوكوندريا العازلة ، ودرجة الحموضة إلى 7.4 وQS إلى 10 مل بالماء المقطر. </li></ul></li></ol> 2. عزل العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في دلو الثلج ، وضعت ثلاثة أكواب 10 مل ، والمطاحن ، Elvehjem بوتر الأنسجة وغيرها من الصكوك كل ما يلزم / لوازم على الجليد. كل شيء يجب أن يبقى الثلج الباردة طوال التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان IB1 وIB2 في دلو الثلج وEB في حمام ماء دافئ عند الانتهاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأكواب three 10 مل ، ينبغي أن تضاف الحلول التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكأس 1 : 10 مل من برنامج تلفزيوني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دورق 2 : 10 مل من PBS / EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دورق 3 : 3 مل من IB1 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قتل الفئران إنسانية على النحو الذي أقرته الخاص المحلي رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بسرعة 250-500 ملغ من الهيكل العظمي والعضلات ، وشطف بيكر في 1 ، ثم نقل إلى الكوب 2. </li></ol> 3. التجانس / عزل الميتوكوندريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العضلات لبيكر (3) واللحم المفروم ناعما العضلات مع المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حل لالخالط بوتر - Elvehjem. التجانس العضلات باستخدام مدقة بمحركات (صحافة الحفر سوف قيام بهذه المهمة) 10 مرات في الحفاظ على أنبوب الثلج في جميع الأوقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جناسة نقل مبردة إلى ما قبل microcentrifuge أنابيب 2 مل والطرد المركزي في 700 غ لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لنقل أنبوب جديد microcentrifuge قبل مبردة. تجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف في أجهزة الطرد المركزي 10500 ز لمدة 10 دقائق على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لنقل أنبوب جديد microcentrifuge قبل المبردة وSN1 تسمية (طاف عدد 1) ونوع العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من IB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ز الطرد المركزي في 10500 لمدة 10 دقائق على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لنقل أنبوب جديد microcentrifuge قبل المبردة وSN2 تسمية (طاف عدد 2) ونوع العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق النهائي الميتوكوندريا بيليه في 100 ميكرولتر من IB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة دوران تعليق الميتوكوندريا النهائي في minifuge لبضع ثوان. إذا كان هناك بيليه ، ونقل طاف لأنبوب جديد microcentrifuge قبل المبردة وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد 8. </li></ol> 4. القطب المعايرة ملاحظة : أكمل المعايرة الكهربائي خلال العزلة الميتوكوندريا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الماء المقطر إلى 250 مل من القارورة. تحريك بقوة لمدة 20 دقيقة للتوازن الماء مع الغاز في الغلاف الجوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بضع قطرات من 50 ٪ إلى القطب بوكل Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة صغيرة من الورق المتداول Rizla الأزرق على قمة القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من الغشاء PTFE على رأس ورقة المتداول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الحلقة الداخلية باستخدام قضيب الطوق ثم ضع الطوق الخارجي في الأخدود الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الأقطاب الكهربائية وتجميع ما تبقى من المعدات : أكبر قاعدة حلقة من البلاستيك ، وغرفة الميتوكوندريا ، وخراطيم المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على صناديق Oxygraph وبدء برنامج Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف الماء إلى الغرفة معايرتها الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة شريط تحريك وتشغيل إلى سرعة 60. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ تجربة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على معايرة ثم السائل المعايرة للمرحلة الإطار 1. التغير في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، وانقر على زر &quot;موافق&quot; مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما &quot;تجاوز&quot; تغييرات &quot;موافق&quot; فوقه وفتح خزان غاز النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غيض مكان متصلة دبابات النتروجين في الغرفة ووضع الأكسجين صفر. Cلعق &quot;موافق&quot; عندما ينتقل من &quot;تجاوز&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الماء وإضافة 500 ميكرولتر من EB العازلة لغرف الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الغرفة مع الغطاس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام صناديق متعددة ، كرر الخطوات 11-15 لمعايرة الإطار 2. </li></ol> 5. الميتوكوندريا التنفس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تجربة جديدة ، فلتكن لتشغيل حوالي 1 دقيقة لتحقيق الاستقرار في الإشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم اللازمة لتعليق الميتوكوندريا (الخطوة 3.11) لمدة 150 ميكروغرام في كل من المجلسين ، الحدث علامة ، والسماح لها الترشح ل1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من الحارة 250 ملي mM/125 الغلوتامات / مالات لتركيز النهائي من 5 ملي mM/2.5. وترك علامة تشغيل لمدة 1 دقيقة. يتم تعريف هذه الدولة كما 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 7.5 ميكرولتر من ADP 10 مم لتركيز النهائي من 150 ميكرومتر ، العلامة ، والسماح للتشغيل لمدة 30 ثانية. يتم تعريف هذه الدولة كما 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة آخر ميكرولتر 7.5 من 10 ملي ADP ، العلامة ، والسماح للتشغيل لمدة 1.5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 ميكرولتر من البرد oligomycin 10 مم لتركيز النهائي من 1 ميكرون ، العلامة ، والسماح للتشغيل لمدة 3 دقائق. ويعرف هذا كدولة 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من البرد FCCP 0.1 ملم لتركيز النهائي من 0.2 ميكرون ، العلامة ، والسماح للتشغيل لمدة 3 دقائق. يتم تعريف هذه الدولة كما 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء ، في نهاية التجربة وحفظها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على معدلات التنفس باستخدام البرمجيات Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل عامل التطبيع : إذا ما أضيف 150 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا ، وعامل تطبيع سيتم 0.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معدلات التنفس طبيعيا لدول تنفس مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة مراقبة الجهاز التنفسي (RCR) بتقسيم الدولة 3 في الدولة 4. </li></ol> 6. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. يظهر ممثل تتبع استهلاك الأوكسجين من قبل العضلات والهيكل العظمي الميتوكوندريا. بعد أن يستقر في إشارة الكهربائي ، إضافة إلى عينة الميتوكوندريا Oxygraph الغرفة. 2 حالة التنفس يبدأ مع اضافة الغلوتامات ومالات. إضافة ADP يزيد استهلاك الأوكسجين ، وتحديد الدولة 3 التنفس. تم حظر سينسيز اعبي التنس المحترفين عن طريق إضافة للحصول على دولة oligomycin 4 التنفس. أخيرا ، إضافة إلى فك الارتباط بين FCCP التنفس الميتوكوندريا (الدولة 5). يبين الجدول 1 معدلات استهلاك الأوكسجين ممثل للدول 2 ، 3 ، 4 و 5. ويتم احتساب نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) لكل تجربة. RCR يعتبر ≥ 4 كدليل على مستحضر الميتوكوندريا قابلة للحياة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الدول </td><td> تطبيع أسعار </td></tr><tr><td> الدولة 2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td> الدولة 3 </td><td> 153.40 </td></tr><tr><td> الدولة 4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td> 5 الدولة </td><td> 143.70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. معدلات التنفس الميتوكوندريا. Representativeoxygen معدلات الاستهلاك من الهيكل العظمي والعضلات الميتوكوندريا. تم تطبيع القيم إلى مبلغ الميتوكوندريا إضافة إلى الغرفة. يتم تحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) بتقسيم الدولة من قبل الدولة 3 4. وRCR ≥ 4 يمثل إعداد قابلة للحياة الميتوكوندريا.

<ol>
	<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease.">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, S96-S102 (2004).</li><li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease.">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia.">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li><li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria:+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function.">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم بروتوكول لعزل الميتوكوندريا قابلة للحياة من عضلات الهيكل العظمي. إذا كان العائد هو المشكلة ، يمكن تعديل البروتوكول من قبل تفرخ في عضلة معزولة في 5 مل من PBS/10mM التربسين EDTA/0.01 ٪ لمدة 30 دقيقة في الجليد. لضمان إتمام عملية الهضم العضلات مع التربسين ، والعضلات تحتاج إلى ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>95% CO2 / 5% O2 mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local gas company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine 5&#x2032;-diphosphate sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A2754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Rizla Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>890101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compressed nitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local gas company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9647</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E3889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0728</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Free fatty acid bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H7006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isotemp 3006D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Male Sprague Dawley Rats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harlan</td>
<td>300-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Malic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C1301P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oligomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygen electrode disc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>S1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygraph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygraph Plus V1.01 Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH-meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>1225506149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3911</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8416</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potter-Elvehjem homogenizers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-414-14A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTFE (0.0125mm &#215; 25mm) membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>S4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SKIL 3320 drill press</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hardware store</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5016</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mitochondrial isolation from skeletal muscle

الميتوكوندريا هي عضيات السيطرة على حياة وموت الخلية. يشاركون في التفاعلات الأيضية الرئيسية ، تجميع معظم لاعبي التنس المحترفين ، وتنظيم عدد من الإشارات شلالات 2،3. وقد عزل الباحثون في الماضي والحاضر الميتوكوندريا من أنسجة الجرذان والفئران مثل المخ والكبد والقلب 4،5. في السنوات الأخيرة ، ركزت العديد من الباحثين على دراسة وظيفة الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي. هنا ، نحن تصف الطريقة التي استخدمناها بنجاح لعزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي 6. إجراءاتنا يتطلب أن يتم إجراء كافة المخازن والكواشف الطازجة ويحتاجون لحوالي 250-500 ملغ من الهيكل العظمي والعضلات. درسنا الميتوكوندريا المعزولة من الساق الجرذان والفئران والحجاب الحاجز والعضلات خارج المقلة الفئران. ويتم قياس تركيز البروتين الميتوكوندريا مقايسة مع برادفورد. من المهم أن تظل عينات الجليد الميتوكوندريا الباردة خلال إعداد وتنفيذ الدراسات أن وظيفية في غضون فترة زمنية قصيرة نسبيا (~ 1 ساعة). ويتم قياس التنفس الميتوكوندريا باستخدام تخطيط الاستقطاب الكهربائي مع كلارك من نوع (Oxygraph النظام) عند 37 درجة مئوية 7. معايرة القطب الأكسجين هو خطوة أساسية في هذا البروتوكول ، ويجب أن يقوم عليها يوميا. الميتوكوندريا المعزولة (150 ميكروغرام) تضاف إلى 0.5 مل من العازلة التجريبية (EB). 2 حالة التنفس يبدأ مع اضافة الغلوتامات (5mM) ومالات (2.5 ملم). ثم ، يضاف ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) (150 ميكرومتر) لبدء ولاية 3. يستخدم Oligomycin (1 ميكرون) ، ومانع سينسيز أتباز ، لتقدير الدولة 4. أخيرا ، الكربونيل السيانيد ف [trifluoromethoxy] هو المضافة فينيل هيدرازون (FCCP ، و 0.2 ميكرومتر) لmeasurestate 5 أو 6 uncoupled التنفس. ويتم احتساب نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) ، ونسبة 3 إلى حالة الدولة 4 ، بعد كل تجربة. يعتبر RCR ≥ 4 كدليل على مستحضر الميتوكوندريا قابلة للحياة. باختصار ، نقدم طريقة لعزل الميتوكوندريا قابلة للحياة من عضلات الهيكل العظمي التي يمكن استخدامها في (مثل نشاط انزيم ، مناعي ، البروتيوميات ،) البيوكيميائية والدراسات الفنية (الميتوكوندريا التنفس).

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle at JoVE.com

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

يصف هذا البروتوكول إجراء دراسة التنفس من الميتوكوندريا المعزولة من عضلات الهيكل العظمي. وقد تم تكييف هذا الأسلوب من Scorrano<em&gt; وآخرون.</em&gt; (2007). لإجراء العزل الميتوكوندريا يتطلب حوالي 2 ساعة. ويمكن الانتهاء من تنفس الميتوكوندريا في حوالي 1 ساعة.

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

28.8K Views.  University of Kentucky. يصف هذا البروتوكول إجراء دراسة التنفس من الميتوكوندريا المعزولة من عضلات الهيكل العظمي. وقد تم تكييف هذا الأسلوب من Scorrano وآخرون. (2007). لإجراء العزل الميتوكوندريا يتطلب حوالي 2 ساعة. ويمكن الانتهاء من تنفس الميتوكوندريا في حوالي 1 ساعة.

Video: Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات قياس التنفس

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Decellularization of Skeletal Muscle 

To begin, inspect the muscles of interest dissected from the sacrificed mouse for the absence of bone chips or ragged edges and trim them away with sharp scissors if needed. Weigh the cleaned muscles using an analytical balance and record their weight. After placing the muscle in at least 0.1 milliliters of 1%SDS per milligram of weight, place the well plate on a rocking shaker set to 50 to 80 Hertz.Visually inspect the SDS solution periodically. When the solution becomes cloudy, remove the solution with a pipette without aspirating the muscles and replace it with an equal volume of fresh 1%SDS. When the solution remains clear for 24 hours, remove the final SDS solution from the decellularized muscles and replace it with an equal volume of PBS.Inspect the decellularized muscles under a stereo microscope and carefully remove any hair or debris stuck to the muscle using forceps. Carefully remove the PBS and replace it with an equal volume of 3.7%formaldehyde before returning the plate to the rocking shaker for 24 hours.