الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التغيرات في تركيزات الكالسيوم الخلوية في الخلايا الحية للتمييز بين الاستجابات العصبية أو الدبقية على أساس كلوريد البوتاسيوم ، أو محفزات ATP. الكالسيوم هو رسول ثان مهم يشارك في العديد من العمليات الخلوية ، بما في ذلك النقل العصبي واللدونة وموت الخلايا المبرمج. أدى ظهور صبغة الكالسيوم الفلورية الانتقائية العالية ، مثل Fura-2 AM ، المرتبطة بتطوير مجاهر فلورية أفضل وطرق حسابية ، إلى بيانات بصرية عالية الدقة مع درجة عالية من الدقة المكانية والزمانية لتصوير إشارات الكالسيوم على الخلايا الحية والكائنات الحية.
هذا البروتوكول قابل للتكيف مع الخلايا العصبية المخصبة أو الدبقية النقية أو الثقافات السكانية المختلطة. يتتبع أنواع الخلايا التي استجابت للمحفزات المحددة بناء على الاستجابة التفاضلية لكلوريد البوتاسيوم و ATP. كلوريد البوتاسيوم يغير إمكانات غشاء الخلية.
وهذا يفتح قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد ، والتي يتم التعبير عنها بشكل أساسي بواسطة الخلايا العصبية. من ناحية أخرى ، يقوم ATP بتنشيط قناة P2X7 ذات الجزء الكبير ، الموجودة بشكل رئيسي في الخلايا الدبقية. عن طريق اقتران كلوريد البوتاسيوم ومحفزات ATP مع أدوية أخرى ، من الممكن معرفة أي حجرة من الجهاز العصبي تستجيب لها ، بناء على زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا.
لهذا الإجراء، ستحتاج إلى بعض الأدوات الجراحية أو الملقط. استخدم خزانة السلامة الأحيائية وقم بأفضل الممارسات لتجنب التلوث. لبدء زراعة شبكية العين الدجاج ، افتح بعناية بيضة مخصبة من القاع ، حيث توجد خلية الهواء.
قم بإزالة المحتويات إلى طبق بتري والمضي قدما في التبرع بالجنين عن طريق قطع الرأس باستخدام زوج من الملقط. بمجرد إزالة الرأس ، أحضره إلى طبق بتري نظيف وأضف إليه بعض المحلول الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بإزالة العينين ، مع الحرص على عدم إتلافها في هذه العملية.
أحضري العين إلى طبق بتري آخر يحتوي على محلول CMF. مع زوج من الملقط ، ابدأ في تشريح العين عن طريق إزالة العدسة. ثم ، بدءا من الثقب الذي تركته العدسة ، قم بإجراء ثلاثة أو أربعة جروح طولية في العين.
قم بإزالة الجسم الزجاجي الشفاف بحذر. تأكد من أن شبكية العين ليست مرتبطة بها. بعد ذلك ، افصل شبكية العين بلطف عن الظهارة المصطبغة.
إزالة أي أنسجة ظهارية متبقية. عندما تكون شبكية العين واضحة تماما ، قم بقصها إلى قطع صغيرة. خذ جميع أنسجة شبكية العين بمساعدة ماصة آلية.
الطرد المركزي لفترة وجيزة شبكية العين لإزالة كل CMF. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين. وتحضن الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
أوقف تفاعل التربسين بإضافة 1 مل من الوسط الذي يحتوي على مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪. الطرد المركزي للشبكية لإزالة كل التربسين. اغسل الخلايا مرتين أو ثلاث مرات بوسط يحتوي على 10٪ FCS.
بعد ذلك ، أضف 2 مل من الوسط لكل شبكية العين وافصلها ميكانيكيا بلطف. قم بتخفيف الخلايا حتى تتمكن من عدها بشكل صحيح باستخدام مقياس الدم. استخدم أغطية مقاس 15 مم محمية بالبولي إل-ليسين واللامينين للمساعدة في التصاق الخلايا.
ماصة 50 لتر من الخلايا المخففة على كل زلة غطاء. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي CO2 5٪. وقم بتبريدها لإرفاق الزجاج.
يجب أن يستغرق هذا حوالي ساعة إلى ساعتين. أضف 1 مل من الوسط وأعده إلى الحاضنة حتى يوم التجربة. إذا لزم الأمر تغيير نصف الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام.
أعد تشكيل قارورة 50 جم من Fura-2 AM مع 50 لترا من DMSO. يعد حل Krebs خيارا جيدا لنقل الخلايا أثناء التجربة ، لأنه لا يتداخل مع قياس التألق. سخني المحلول إلى 37 قبل البدء.
أضف بولوكسامير 407. أضف Fura-2 AM و DMSO. سونيك لمدة سبع دقائق في حمام مائي.
قم بإعداد لوحة من 6 آبار تضيف محلول Krebs إلى ثلاثة آبار وحل Fura-2 العامل على آخر. اغسل الغطاء الذي يحتوي على خلاياك ثلاث مرات قبل إضافته إلى بئر Fura-2. احتضان الخلايا في الغلاف الجوي 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 30 دقيقة في حاضنة مظلمة.
بعد الحضانة ، اغسلها ثلاث مرات مرة أخرى. نقله إلى مستلم آخر يحتوي على كريبس وحمايته من الضوء. من الممكن إعادة استخدام Fura-2 المحضر لاحتضان المزيد من الأغطية بالخلايا.
أضف السيليكون إلى دعامة الغطاء والغرفة قبل كل تشغيل لتجنب تسرب المحلول. أخرج الغطاء من محلول كريبس واغسل القاع بعناية بالماء المقطر لتجنب تبلور الملح على عدسة المجهر. ضع الغطاء على الدعامة ، واضغط على الحدود بحذر.
قم بتوصيل دعامة الغطاء والغرفة بالمجهر ، وابدأ في دمج الخلايا بمحلول Krebs. حدد الخلايا المناسبة واختر حقلا جيدا. تحديد المناطق ذات الاهتمام يدويا عن طريق اختيار أجسام الخلايا بناء على مورفولوجيتها المتميزة.
تم تقييم الاختلافات في تركيز الكالسيوم عن طريق تحديد نسبة التألق المنبعث عند 510 نانومتر بعد الإثارة البديلة عند 340 و 380 نانومتر. بعد إضافة كلوريد البوتاسيوم ، من الممكن رؤية العديد من الخلايا متوهجة واستجابة التألق ترتفع على الرسم البياني. كلوريد البوتاسيوم يفتح قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد ، ويقدم أساسا في الخلايا العصبية.
يمثل كل سطر فردي على الرسم البياني المنطقة الفريدة المثيرة للاهتمام. لذلك ، من الممكن تتبع استجابات الخلايا الفردية أثناء التجربة. تفتح محفزات ATP مستقبلات P2X7 ، التي يتم التعبير عنها بشكل أساسي بواسطة الخلايا الدبقية.
هذه ثقافة عصبية مخصبة. لذلك ، هناك عدد قليل من الخلايا الدبقية هنا. هذا هو السبب في أن عددا قليلا جدا من الخلايا يستجيب لمحفزات ATP.
تمت معالجة القيم المكتسبة باستخدام برنامج Metafluor. يتم التعبير عن النتائج التجريبية في جدول Excel، حيث يمثل كل صف خلية فردية، وكل سطر نقطة زمنية. باستخدام برنامج Excel ، من الممكن رسم اختلافات الكالسيوم للخلايا الفردية بشكل منفصل ، أو جميعها في نفس الرسم البياني.
لتحديد كمية الخلايا التفاعلية لأي حافز ، قم بتعيين حد أقصى بنسبة 30٪ لزيادة مستويات خط الأساس للكالسيوم. هنا نستخدم خلايا شبكية العين في الثقافة من فراخ اليوم الجنيني 8 للتحقيق في كيفية إشارة الخلايا العصبية والدبقية من حيث تحولات الكالسيوم ، بعد تلقي 50 مم كلوريد البوتاسيوم ومحفزات ATP 1 مم. في كل تجربة ، تم تحليل حوالي 100 خلية بسهولة.
يمثل الشكل (أ) ثقافة مختلطة تحتوي على كل من الخلايا العصبية والدبقية ، والتي تم الحفاظ عليها لمدة أسبوع واحد. عندما نقيس الاستجابات كميا ، من الممكن أن نرى أن حوالي نصف الخلايا التي تم تحليلها تجيب على كلوريد البوتاسيوم ، والنصف الآخر يستجيب ل ATP. يشير الشكل B إلى ثقافة غنية بالخلايا العصبية.
تم احتضانها لمدة ثلاثة أيام فقط ، وبالتالي ، فإن معظم الخلايا الدبقية لم تتمايز بعد. في هذه الحالة ، 89 ٪ من الخلايا تجيب على كلوريد البوتاسيوم ، مما يعزز انتشار الخلايا العصبية. يوضح الشكل C ثقافة دبقية نقية.
تم الحفاظ على هذه الخلايا لمدة 10 أيام مع تغييرات متوسطة كل ثلاثة أيام. بعد ذلك الوقت تموت معظم الخلايا العصبية ، تاركة الدبقية فقط. في الواقع ، تم تنشيط هذه الثقافة فقط من قبل ATP.
وقد استخدمت هذه المنهجية على نطاق واسع بسبب الخصائص العالمية للكالسيوم كرسول ثان. يمكن تعزيز التحليل الظاهري من خلال استكمال هذه المنهجية بالكيمياء المناعية للخلايا الثابتة بعد تصوير الكالسيوم. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة الخلايا المختلطة الأخرى التي تعبر عن قنوات الكالسيوم الأخرى.
النصيحة المهمة هي العثور على استجابات انتقائية لأنواع مختلفة من الخلايا المرتبطة بتعبيرها الظاهري.
