이 절차의 전반적인 목표는 염화칼륨 또는 ATP 자극에 따라 신경 세포 또는 아교세포 반응을 분화시키기 위해 살아있는 세포의 세포질 칼슘 농도의 변화를 모니터링하는 것입니다. 칼슘은 신경 전달, 가소성 및 아폽토시스를 포함한 여러 세포 과정에 관여하는 중요한 두 번째 메신저입니다. Fura-2 AM과 같은 높은 선택적 형광 칼슘 염료의 출현은 더 나은 형광 현미경 및 계산 방법의 개발과 관련하여 살아있는 세포 및 유기체에서 칼슘 신호 전달을 이미지화하기 위해 높은 수준의 공간 및 시간 분해능을 가진 고해상도 광학 데이터를 산출했습니다.
이 프로토콜은 농축 뉴런, 정제된 신경교세포 또는 혼합 집단 배양에 적응할 수 있다. 그것은 염화칼륨 및 ATP에 대한 차별적 인 반응을 기반으로 확정 된 자극에 반응 한 세포 유형을 추적합니다. 염화칼륨은 세포의 막 잠재력을 변화시킵니다.
그리고 이것은 본질적으로 뉴런에 의해 표현되는 전압 게이트 칼슘 채널을 엽니 다. 한편, ATP는 주로 신경교세포에 존재하는 P2X7 큰 부분 채널을 활성화시킨다. 염화칼륨과 ATP 자극을 다른 약물과 결합시킴으로써 세포 내 칼슘 농도의 증가에 따라 신경계의 어느 구획이 반응하는지 확인할 수 있습니다.
이 절차를 위해서는 수술 도구 또는 핀셋이 필요합니다. 생물 안전 캐비닛을 사용하고 오염을 피하기 위해 모범 사례를 수행하십시오. 닭 망막 배양을 시작하려면 공기 세포가있는 바닥에서 수정 된 난자를 조심스럽게 엽니 다.
페트리 접시에 내용물을 제거하고 핀셋 한 켤레로 감금하여 배아 기증을 진행하십시오. 머리가 제거되면 깨끗한 페트리 접시에 가져 와서 칼슘과 마그네슘이없는 용액을 첨가하십시오. 다음으로, 눈을 제거하고 그 과정에서 눈을 손상시키지 않도록주의하십시오.
CMF 용액이 들어있는 다른 페트리 접시에 눈을 가져 오십시오. 한 쌍의 핀셋으로 렌즈를 제거하여 눈을 해부하기 시작하십시오. 그런 다음 렌즈가 남긴 구멍으로 시작하여 눈에 서너 개의 세로 컷을 수행하십시오.
투명한 유리체 몸체를 조심스럽게 제거하십시오. 망막이 그것에 묶여 있지 않은지 확인하십시오. 다음으로, 색소 침착 된 상피에서 망막을 부드럽게 분리하십시오.
남아있는 상피 조직을 제거하십시오. 망막이 완전히 맑으면 작은 조각으로 자르십시오. 자동화 된 피펫을 사용하여 모든 망막 조직을 가져 가십시오.
망막을 간단히 원심분리하여 모든 CMF를 제거한다. 0.25 % 트립신 1 mL를 첨가하십시오. 조직을 37C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
10%우태아 송아지 혈청을 함유하는 배지 1 mL를 첨가하여 트립신 반응을 중지시킨다. 망막을 원심분리하여 모든 트립신을 제거한다. 세포를 10%FCS를 함유하는 배지로 두세 번 세척한다.
다음으로, 망막 당 2 mL의 배지를 첨가하고 부드럽게 기계적으로 해리시킨다. 혈구계로 적절하게 셀 수 있도록 세포를 희석하십시오. 폴리-L-라이신 및 라미닌으로 보호되는 15mm 커버슬립을 사용하여 세포 접착력을 돕습니다.
각 커버 슬립에 희석 된 세포 50 L를 피펫하십시오. 세포를 5% CO2 분위기에서 37C에서 배양한다. 그리고 유리를 부착하기 위해 그들을 식히십시오.
이 작업에는 약 한두 시간이 소요됩니다. 배지 1 mL를 넣고 실험 당일까지 인큐베이터로 반납한다. 필요한 경우 이틀에서 사흘마다 매체의 절반을 교체하십시오.
Fura-2 AM 50g 바이알을 DMSO 50L와 함께 재구성하십시오. 크렙스 용액은 형광 측정을 방해하지 않기 때문에 실험 중에 세포를 전달하는 좋은 옵션입니다. 시작하기 전에 용액을 37로 예열하십시오.
폴록사머 407을 추가합니다. Fura-2 AM 및 DMSO를 추가합니다. 수조에서 일곱 분 동안 초음파 처리하십시오.
세 개의 웰에 Krebs 용액을 추가하고 다른 웰에 작동하는 Fura-2 용액을 첨가하는 6 웰 플레이트를 준비하십시오. Fura-2 웰에 추가하기 전에 세포가 들어있는 커버슬립을 세 번 씻으십시오. 세포를 어두운 인큐베이터에서 30분 동안 37C 및 5%CO2 분위기에서 배양한다.
배양 후 다시 세 번 씻으십시오. 크렙스가 들어있는 다른 수령인에게 전달하고 빛으로부터 보호하십시오. 준비된 Fura-2를 재사용하여 세포와 함께 더 많은 커버슬립을 배양할 수 있습니다.
용액 누출을 방지하기 위해 각 실행 전에 커버슬립 지지대와 챔버에 실리콘을 추가하십시오. Krebs 용액에서 커버 슬립을 꺼내 현미경 렌즈에서 소금 결정화를 피하기 위해 증류수로 바닥을 조심스럽게 씻으십시오. 커버 슬립을 지지대에 놓고 조심스럽게 테두리를 누르십시오.
커버슬립 지지대와 챔버를 현미경에 부착하고 세포를 크렙스 용액으로 관류하기 시작합니다. 적절한 셀을 선택하고 좋은 필드를 선택합니다. 그들의 뚜렷한 형태학에 기초하여 세포체를 선택함으로써 관심 영역을 수동으로 결정한다.
칼슘 농도의 변동은 340 및 380 nm에서 번갈아 여기한 후 510 nm에서 방출되는 형광의 비율을 정량화하여 평가하였다. 염화칼륨을 첨가한 후 많은 세포가 빛나고 형광 반응이 그래프에서 상승하는 것을 볼 수 있습니다. 염화 칼륨은 전압 게이트 칼슘 채널을 열고 주로 뉴런에 나타납니다.
그래프의 각 개별 선은 고유한 관심 영역을 나타냅니다. 따라서, 실험 동안 개별 세포 반응을 추적할 수 있다. ATP 자극은 본질적으로 신경교 세포에 의해 발현되는 P2X7 수용체를 개방한다.
이것은 풍부한 뉴런 문화입니다. 따라서 여기에는 아교 세포가 거의 없습니다. 이것이 ATP 자극에 반응하는 세포가 거의 없는 이유입니다.
획득한 값은 Metafluor 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다. 실험 결과는 Excel 테이블로 표현되며, 각 행은 개별 셀과 각 줄은 시점을 나타냅니다. Excel 소프트웨어를 사용하면 개별 세포의 칼슘 변이를 개별적으로 또는 모든 세포의 칼슘 변형을 동일한 그래프로 플롯 할 수 있습니다.
모든 자극에 대한 반응성 세포의 양을 정량화하려면 칼슘 기준선 수준을 30% 증가시키는 컷오프를 설정하십시오. 여기서 우리는 배아 8 일째 병아리에서 배양하는 망막 세포를 사용하여 50mm 염화칼륨과 1mm ATP 자극을받은 후 칼슘 이동의 관점에서 뉴런과 글리아 신호가 어떻게 변하는지를 조사합니다. 각 실험에서, 약 100개의 세포를 용이하게 분석하였다.
도 A는 뉴런과 신경교세포 둘 다를 함유하는 혼합 배양물을 나타내며, 즉 일주일 동안 유지되었다. 우리가 반응을 정량화 할 때, 분석 된 세포의 약 절반이 염화칼륨에 반응하고 나머지 절반은 ATP에 반응한다는 것을 알 수 있습니다. 도 B는 뉴런 풍부 배양물을 의미한다.
단지 사흘 동안 배양되었고, 따라서 대부분의 신경교세포는 아직 분화되지 않았다. 이 경우 세포의 89 %가 염화칼륨에 반응하여 뉴런의 유병률을 강화합니다. 도 C는 정제된 신경교세포 배양물을 나타낸다.
이들 세포는 3일마다 배지 변화와 함께 10일 동안 유지되었다. 그 시간이 지나면 대부분의 뉴런이 죽고 글리아 만 남습니다. 실제로이 문화는 ATP에 의해서만 활성화되었습니다.
이 방법론은 두 번째 메신저로서의 칼슘의 보편적 인 특성으로 인해 광범위하게 사용되었습니다. 표현형 분석은 칼슘 이미징 후 고정 된 세포의 면역 화학으로이 방법론을 보완함으로써 향상 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 칼슘 채널을 발현하는 다른 혼합 세포 시스템에 적응될 수 있다.
중요한 팁은 표현형 발현과 상관 관계가 있는 다양한 유형의 세포의 선택적 반응을 찾는 것입니다.
