Общей целью этой процедуры является мониторинг изменений концентрации цитозольного кальция в живых клетках для дифференциации нейронных или глиальных реакций на основе хлорида калия или стимулов АТФ. Кальций является важным вторым мессенджером, участвующим в нескольких клеточных процессах, включая нейротрансмиссию, пластичность и апоптоз. Появление высокоселективного флуоресцентного кальциевого красителя, такого как Fura-2 AM, связанного с разработкой более совершенных флуоресцентных микроскопов и методов вычислений, дало оптические данные высокого разрешения с высокой степенью пространственного и временного разрешения для изображения кальциевой сигнализации на живых клетках и организмах.
Этот протокол адаптируется к обогащенным нейронам, очищенной глии или смешанным популяционным культурам. Он отслеживает, какие типы клеток реагировали на определенные стимулы на основе дифференциального ответа на хлорид калия и АТФ. Хлорид калия изменяет мембранный потенциал клетки.
И это открывает напряжение закрытых кальциевых каналов, экспрессируемое в основном нейронами. С другой стороны, АТФ активирует канал P2X7 большой части, присутствующий в основном в глиальных клетках. Связав хлорид калия и АТФ-стимулы с другими препаратами, можно увидеть, какой на них реагирует компартмент нервной системы, исходя из повышения внутриклеточной концентрации кальция.
Для этой процедуры вам понадобятся некоторые хирургические инструменты или пинцет. Используйте шкаф биобезопасности и выполняйте лучшие практики, чтобы избежать загрязнения. Чтобы начать культуру куриной сетчатки, осторожно откройте оплодотворенную яйцеклетку у дна, где находится воздушная клетка.
Извлеките содержимое в чашку Петри и приступайте к донорству эмбриона путем обезглавливания парой пинцета. Как только головка будет удалена, поднесите ее в чистую чашку Петри и добавьте в нее немного раствора без кальция и магния. Далее удаляют глаза, следя за тем, чтобы не повредить их в процессе.
Поднесите глаз к другой чашке Петри, содержащей раствор CMF. С помощью пары пинцетов начните рассекать глаз, удалив хрусталик. Затем, начав с отверстия, оставленного хрусталиком, сделайте три или четыре продольных разреза в глазу.
Удаляют прозрачное стекловидное тело с осторожностью. Убедитесь, что сетчатка не привязана к ней. Далее аккуратно отделяют сетчатку от пигментированного эпителия.
Удалите оставшуюся эпителиальную ткань. Когда сетчатка станет полностью прозрачной, разрежьте ее небольшими кусочками. Возьмите всю ткань сетчатки с помощью автоматизированной пипетки.
Кратковременно центрифугируйте сетчатку, чтобы удалить весь CMF. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина. И инкубировать ткани при 37 С в течение 10 минут.
Остановите реакцию трипсина, добавив 1 мл среды, содержащей 10% сыворотки для телят плода. Центрифугируйте сетчатку, чтобы удалить весь трипсин. Промыть клетки два-три раза средой, содержащей 10% FCS.
Затем добавьте 2 мл среды на сетчатку и осторожно механически диссоциируйте ее. Разбавьте клетки, чтобы вы могли правильно их посчитать с помощью гемоцитометра. Используйте 15-миллиметровые крышки, защищенные поли-L-лизином и ламинином, чтобы помочь адгезии клеток.
Пипетка 50 л ваших разбавленных ячеек на каждом крышке. Инкубируйте клетки при 37 ° C в атмосфере 5% CO2. И охладите их, чтобы прикрепить стекло.
Это должно занять около одного-двух часов. Добавьте 1 мл среды и верните ее в инкубатор до дня эксперимента. При необходимости меняйте половину среды каждые два-три дня.
Восстановите флакон 50 г Fura-2 AM с 50 л ДМСО. Раствор Кребса является хорошим вариантом для переноса клеток во время эксперимента, поскольку он не мешает измерению флуоресценции. Перед началом разогрейте раствор до 37.
Добавить полоксамер 407. Добавьте Fura-2 AM и DMSO. Настаивайте его ультразвуком в течение семи минут на водяной бане.
Приготовьте 6-луночную плиту, добавив раствор Кребса в три скважины и рабочий раствор Фура-2 на другую. Вымойте крышку, содержащую ваши клетки три раза, прежде чем добавлять в колодец Fura-2. Инкубируйте клетки при 37 С и 5% CO2 атмосферы в течение 30 минут в темном инкубаторе.
После инкубации промыть его три раза еще раз. Передайте его другому получателю, содержащему Кребса, и защитите его от света. Можно повторно использовать приготовленную Fura-2 для инкубации большего количества покровов с клетками.
Добавляйте кремний в опору и камеру крышки перед каждым запуском, чтобы избежать утечки раствора. Выньте крышку из раствора Кребса и тщательно промойте дно дистиллированной водой, чтобы избежать кристаллизации соли на линзе микроскопа. Положите крышку на опору, нажимая на бордюры с осторожностью.
Прикрепите крышку и камеру к микроскопу и начните перфузию клеток раствором Кребса. Выделите соответствующие ячейки и выберите хорошее поле. Вручную определите интересующие области, выделив клеточные тела на основе их различной морфологии.
Изменения концентрации кальция оценивали путем количественной оценки соотношения флуоресценции, испускаемой при 510 нм после попеременного возбуждения при 340 и 380 нм. После добавления хлорида калия можно увидеть на графике много светящихся клеток и повышение реакции флуоресценции. Хлорид калия открывает напряжение закрытых кальциевых каналов, присутствует в основном в нейронах.
Каждая отдельная линия на графике представляет собой уникальную область интереса. Таким образом, можно отслеживать отдельные реакции клеток во время эксперимента. АТФ-стимулы открывают рецептор P2X7, по существу экспрессируемый глиальными клетками.
Это обогащенная нейронная культура. Поэтому глиальных клеток здесь немного. Это причина, по которой так мало клеток реагируют на стимулы АТФ.
Полученные значения обрабатывались с помощью программного обеспечения Metafluor. Экспериментальные результаты выражаются в таблице Excel, где каждая строка представляет отдельную ячейку, а каждая строка — точку времени. Используя программное обеспечение Excel, можно строить вариации кальция отдельных клеток отдельно или всех их на одном графике.
Чтобы количественно оценить количество реактивных клеток на любой стимул, установите отсечение на 30%, увеличив базовые уровни кальция. Здесь мы используем клетки сетчатки в культуре из эмбриональных цыплят 8-го дня, чтобы исследовать, как нейроны и глия сигнализируют с точки зрения сдвигов кальция после получения 50 мм хлорида калия и 1 мм стимулов АТФ. В каждом эксперименте было легко проанализировано около 100 клеток.
Рисунок А представляет собой смешанную культуру, содержащую как нейроны, так и глию, которая поддерживалась в течение одной недели. Когда мы количественно оцениваем ответы, можно увидеть, что около половины проанализированных клеток отвечают на хлорид калия, а другая половина ответила на АТФ. Рисунок B относится к культуре, обогащенной нейронами.
Он инкубировался всего три дня, поэтому большинство глиальных клеток еще не дифференцировались. При этом 89% клеток отвечают хлориду калия, усиливая преобладание нейронов. На рисунке C показана очищенная культура глии.
Эти клетки поддерживались в течение 10 дней со средними изменениями каждые три дня. После этого времени большая часть нейронов погибает, оставляя только глию. Действительно, эта культура была активирована исключительно АТФ.
Эта методология широко используется из-за универсальных свойств кальция как второго мессенджера. Фенотипический анализ может быть улучшен путем дополнения этой методологии иммунохимией фиксированных клеток после визуализации кальция. Этот протокол также может быть адаптирован к другим смешанным клеточным системам, экспрессирующим другие кальциевые каналы.
Важным советом является поиск селективных реакций различных типов клеток, коррелирующих с их фенотипической экспрессией.
