L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare i cambiamenti nelle concentrazioni di calcio citosolico nelle cellule vive per differenziare le risposte neuronali o gliali in base al cloruro di potassio o agli stimoli ATP. Il calcio è un importante secondo messaggero coinvolto in diversi processi cellulari, tra cui neurotrasmissione, plasticità e apoptosi. L'avvento del colorante di calcio fluorescente ad alta selettività, come Fura-2 AM, associato allo sviluppo di migliori microscopi fluorescenti e metodi di calcolo, ha prodotto dati ottici ad alta risoluzione con un alto grado di risoluzione spaziale e temporale per l'immagine della segnalazione del calcio su cellule e organismi viventi.
Questo protocollo è adattabile a neuroni arricchiti, glia purificati o colture a popolazione mista. Tiene traccia di quali tipi di cellule hanno risposto a determinati stimoli in base alla risposta differenziale al cloruro di potassio e all'ATP. Il cloruro di potassio modifica il potenziale di membrana della cellula.
E questo apre canali del calcio voltaggio-dipendenti, espressi essenzialmente dai neuroni. D'altra parte, ATP attiva il canale P2X7 di grandi dimensioni, presente principalmente nelle cellule gliali. Accoppiando gli stimoli del cloruro di potassio e dell'ATP con altri farmaci, è possibile vedere quale compartimento del sistema nervoso sta rispondendo a loro, in base all'aumento della concentrazione intracellulare di calcio.
Per questa procedura, avrai bisogno di alcuni strumenti chirurgici o pinzette. Utilizzare un armadio di biosicurezza ed eseguire le migliori pratiche per evitare la contaminazione. Per iniziare la coltura della retina di pollo, aprire con attenzione un uovo fecondato sul fondo, dove si trova la cellula dell'aria.
Rimuovere il contenuto in una capsula di Petri e procedere con la donazione dell'embrione per decapitazione con un paio di pinzette. Una volta rimossa la testa, portarla in una capsula di Petri pulita e aggiungere una soluzione priva di calcio e magnesio. Quindi, rimuovere gli occhi, facendo attenzione a non danneggiarli nel processo.
Portare l'occhio su un'altra capsula di Petri contenente soluzione di CMF. Con un paio di pinzette, inizia a sezionare l'occhio rimuovendo la lente. Quindi, partendo dal foro lasciato dalla lente, fai tre o quattro tagli longitudinali nell'occhio.
Rimuovere il corpo vitreo trasparente con cautela. Assicurarsi che la retina non sia legata ad essa. Quindi, staccare delicatamente la retina dall'epitelio pigmentato.
Rimuovere qualsiasi tessuto epiteliale rimanente. Quando la retina è totalmente chiara, tagliarla a pezzetti. Prendi tutto il tessuto della retina con l'aiuto di una pipetta automatizzata.
Centrifugare brevemente la retina per rimuovere tutta la CMF. Aggiungere 1 ml di 0,25% di tripsina. E incubare il tessuto a 37 ° C per 10 minuti.
Interrompere la reazione alla tripsina aggiungendo 1 mL di mezzo contenente il 10% di siero fetale del vitello. Centrifugare la retina per rimuovere tutta la tripsina. Lavare le cellule due o tre volte con un mezzo contenente il 10% di FCS.
Quindi, aggiungere 2 ml di mezzo per retina e dissociarlo delicatamente meccanicamente. Diluire le cellule in modo da poterle contare correttamente con un emocitometro. Utilizzare coperture da 15 mm protette con poli-L-lisina e laminina per aiutare l'adesione cellulare.
Pipettare 50 L delle cellule diluite su ogni coverslip. Incubare le cellule a 37 C in atmosfera al 5% di CO2. E raffreddarli per attaccare il bicchiere.
Questo dovrebbe richiedere circa una o due ore. Aggiungere 1 mL di mezzo e restituirlo all'incubatrice fino al giorno dell'esperimento. Se necessario, cambiare metà del mezzo ogni due o tre giorni.
Ricostituire un flaconcino da 50 g di Fura-2 AM con 50 L di DMSO. La soluzione di Krebs è una buona opzione per trasferire le cellule durante l'esperimento, perché non interferisce con la misurazione della fluorescenza. Preriscaldare la soluzione a 37 prima di iniziare.
Aggiungere Poloxamer 407. Aggiungi Fura-2 AM e DMSO. Sonicatelo per sette minuti a bagnomaria.
Preparare una piastra a 6 pozzetti aggiungendo la soluzione krebs a tre pozzetti e la soluzione Fura-2 funzionante su un altro. Lavare il coverslip contiene le cellule tre volte prima di aggiungere al fura-2 bene. Incubare le cellule a 37 C e 5% di CO2 per 30 minuti in un incubatore buio.
Dopo l'incubazione, lavarlo di nuovo tre volte. Trasferiscilo a un altro recipiente contenente Krebs e proteggilo dalla luce. È possibile riutilizzare il Fura-2 preparato per incubare più coverslip con le cellule.
Aggiungere silicio al supporto e alla camera del coperchio prima di ogni corsa per evitare perdite di soluzione. Estrarre il coverslip dalla soluzione di Krebs e lavare accuratamente il fondo con acqua distillata per evitare la cristallizzazione del sale sulla lente del microscopio. Metti la coverslip sul supporto, premendo i bordi con cautela.
Collegare il supporto e la camera del coverslip al microscopio e iniziare a perfondere le cellule con la soluzione di Krebs. Selezionare le celle appropriate e scegliere un buon campo. Determinare manualmente le regioni di interesse selezionando i corpi cellulari in base alla loro morfologia distinta.
Le variazioni della concentrazione di calcio sono state valutate quantificando il rapporto della fluorescenza emessa a 510 nm a seguito di eccitazione alternata a 340 e 380 nm. Dopo aver aggiunto cloruro di potassio è possibile vedere molte cellule incandescenti e la risposta di fluorescenza che si alza sul grafico. Il cloruro di potassio apre canali del calcio voltaggio-dipendenti, presenti principalmente nei neuroni.
Ogni singola linea del grafico rappresenta la regione unica di interesse. Pertanto, è possibile tenere traccia delle singole risposte cellulari durante l'esperimento. Gli stimoli ATP aprono il recettore P2X7, essenzialmente espresso dalle cellule gliali.
Questa è una cultura neuronale arricchita. Pertanto, ci sono poche cellule gliali qui. Questo è il motivo per cui così poche cellule rispondono agli stimoli dell'ATP.
I valori acquisiti sono stati elaborati utilizzando il software Metafluor. I risultati sperimentali sono espressi in una tabella excel, in cui ogni riga rappresenta una singola cella e ogni riga un punto temporale. Utilizzando il software Excel, è possibile tracciare separatamente le variazioni di calcio delle singole celle o di tutte sullo stesso grafico.
Per quantificare la quantità di cellule reattive a qualsiasi stimolo, impostare un cutoff del 30% aumentando i livelli basali di calcio. Qui usiamo cellule della retina in coltura da pulcini embrionali del giorno 8 per studiare come i neuroni e la glia segnalano in termini di spostamenti di calcio, dopo aver ricevuto 50 mm di cloruro di potassio e 1 mm di STIMOLI ATP. In ogni esperimento, circa 100 cellule sono state prontamente analizzate.
La figura A rappresenta una coltura mista contenente sia neuroni che glia, che è stata mantenuta per una settimana. Quando quantifichiamo le risposte, è possibile vedere che circa la metà delle cellule analizzate risponde al cloruro di potassio e l'altra metà risponde all'ATP. La figura B si riferisce a una cultura arricchita di neuroni.
È stato incubato per soli tre giorni, quindi la maggior parte delle cellule gliali non si è ancora differenziata. In questo caso, l'89% delle cellule risponde al cloruro di potassio, rafforzando la prevalenza dei neuroni. La figura C mostra una cultura glia purificata.
Queste cellule sono state mantenute per 10 giorni con cambiamenti medi ogni tre giorni. Dopo quel tempo la maggior parte dei neuroni muore, lasciando solo glia. In effetti, questa cultura è stata attivata esclusivamente dall'ATP.
Questa metodologia è stata ampiamente utilizzata a causa delle proprietà universali del calcio come secondo messaggero. L'analisi fenotipica può essere migliorata completando questa metodologia con l'immunochimica delle cellule fisse dopo l'imaging del calcio. Questo protocollo potrebbe anche essere adattato ad altri sistemi cellulari misti che esprimono altri canali del calcio.
Il consiglio importante è quello di trovare risposte selettive di diversi tipi di cellule correlate con la loro espressione fenotipica.
