لقد طورنا طريقة جديدة باستخدام محلل فرس البحر XF لقياس معدل استهلاك الأكسجين مباشرة. لكن الوكيل الشائع لوظيفة الميتوكوندريا في شريحة الشريحة الحادة من الفئران البالغة. تقيس هذه الطريقة خلية عن طريق الطاقة في ثقوب من هياكل الدماغ المحددة تشريحيا.
إن استخدام الشرائح الحادة يحاكي بشكل أوثق البيئة الخلوية الفسيولوجية التي لا يمكن تحقيقها بطرق معزولة من الميتوكوندريا أو الخلايا الثقافية. ستكون هذه الطريقة ذات أهمية واسعة للباحثين العاملين في مجال مرض باركنسون ومرض هنتنغتون. للبدء، افتح مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية وقم بإزالة كل من خرطوشة المستشعر ولوحة الأداة المساعدة.
ثم ضع خرطوشة المستشعر جانبا ولا تلمس المستشعرات. بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من محلول المعايرة إلى كل جدار من لوحة المرافق. ضع خرطوشة المستشعر أعلى لوحة الأداة المساعدة واغمر المستشعرات في محلول المعايرة، مما يضمن محاذاة الشق الثلاثي للوحة الأداة المساعدة وخرطوشة المستشعر بشكل صحيح.
بعد ذلك ، قم بإغلاق مجموعة فحص التدفق خارج الخلية بفيلم مانع للتسرب لمنع تبخر محلول المعايرة ثم ضعه في حاضنة 37 درجة مئوية غير مكملة بثاني أكسيد الكربون أو الأكسجين ، بين عشية وضحاها. افتح لوحة التقاط الثقب الدقيقة وأخرج لوحة الثقب لجلوس الأنسجة. ثم قم بتسخين حجم مناسب من السائل الشوكي الاصطناعي المعدل مسبقا إلى 37 درجة مئوية في أنبوب 50 ملليلتر.
بعد ذلك أضف BSA إلى تركيز نهائي قدره أربعة ملليغرام لكل ملليلتر لإعداد المخزن المؤقت للتنفس. أضف 625 ميكرولتر من عازل التنفس إلى كل بئر من صفيحة الثقب بعناية مع تجنب اهتزاز الصفيحة ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هواء في المخزن المؤقت لكل بئر. تشريح الدماغ على الفور في 10 ملليلتر من محلول القطع المؤكسج قبل الجليد البارد.
ثم ، باستخدام شرائح السترياتال الإكليلية في القسم الاهتزازي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة بسماكة 150 ميكرومتر في محلول القطع المؤكسج مسبقا على الجليد البارد. بعد ذلك ، استرجع الشرائح في 50 ملليلتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المؤكسج. واحتفظ بها في محلول لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الشفاء ، انقل الشرائح إلى طبق بتري 35 × 10 ملم مع خمسة ملليمترات من المخزن المؤقت للتنفس. باستخدام لكمة خزعة الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بإنشاء قطعة دائرية من الأنسجة في المنطقة المطلوبة من الدماغ المقطع عن طريق الضغط بلطف على اللكمة مع الحفاظ على الشريحة في المخزن المؤقت. ثم قم بإزالة بقية الأنسجة ، وارفع اللكمة بعيدا وأزل القطعة الدائرية من الأنسجة في المخزن المؤقت.
بعد ذلك ، قم بقطع نهاية طرف ماصة بملليلتر واحد لعمل ثقب بقطر من نقطة واحدة إلى نقطتين إلى نقطتين صفر ملليمتر واستخدامه لحمل الشريحة المثقوبة ونقلها إلى الجزء العلوي من شاشة الالتقاط. شفط قطعة واحدة من أنسجة المخ المثقوبة ووضع الأنسجة بعناية على الجانب الشبكي من شاشة الالتقاط، وهي قطعة دائرية من البلاستيك مع شبكة متصلة بجانب واحد. باستخدام منديل ورقي ، قم بتجفيف شاشة الالتقاط بلطف وإزالة الرطوبة ، مما يسمح للأنسجة بأن تصبح لزجة وتعلق على مركز الشبكة.
بعد ذلك ، أمسك شاشة الالتقاط على جانب الشريحة لأسفل باستخدام ملاقط وضعها في أحد آبار لوحة الثقب الحاضنة. ثم احتضن صفيحة الثقب عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بتوازن درجة الحرارة ودرجة الحموضة قبل إجراء الفحص. قم بتخفيف المركبات المطلوبة والسائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المعدل بدون BSA إلى تركيز المخزون النهائي لتركيز العمل للمنافذ A إلى D ، على التوالي.
قم بتحميل 75 ميكرولتر من المركبات المخففة بلطف في منافذ الحقن المناسبة لخرطوشة المستشعر عن طريق وضع الأطراف في منتصف الطريق في منافذ الحقن بزاوية 45 درجة مع وضع الطرف على جدار منفذ الحقن ، حيث قد يتسبب الإدخال الكامل في تسرب مركب عبر المنفذ. بعد ذلك ، اسحب الأطراف من المنافذ بعناية دون إنشاء فقاعات هواء ولا تنقر على أي جزء من الخرطوشة لتجنب تخفيف فقاعات الهواء. ثم افحص منافذ الحقن بصريا للتحميل حتى لضمان وجود جميع السوائل في المنفذ وعدم وجود قطرات متبقية أعلى الخرطوشة.
بعد وضع خرطوشة المستشعر على لوحة المرافق ، ضعها في حاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح لها بتسخين ما يصل إلى 37 درجة مئوية أثناء التعامل معها بعناية عن طريق التمسك فقط بلوحة المرافق والتحرك بأقل قدر ممكن. قم أولا بتحميل قالب الفحص في البرنامج ثم اضغط على زر البدء الأخضر. ثم قم بتحميل خرطوشة المستشعر على لوحة الأدوات المساعدة في درج الأدوات، مما يضمن بقاء اللوحة بشكل صحيح ومسطح، وتحميل خرطوشة المستشعر المملوءة بالأدوية في المحلل للمعايرة.
بعد ذلك ، اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة من أجل المعايرة. وموازنة أجهزة الاستشعار. بمجرد الانتهاء من خطوة التوازن ، قم بإزالة لوحة المعايرة واستبدلها بلوحة الثقب التي تحتوي على شرائح الشبكة والأنسجة.
ثم قم بقياس معدل استهلاك الأكسجين في كل بئر من اللوحة، باستخدام بروتوكولات الفحص كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، قم بتحليل بيانات قياس معدل استهلاك الأكسجين وبيانات كفاءة الاقتران. أظهرت معدلات استهلاك الأكسجين لمختلف السماكات وأحجام اللكمات للشرائح في المجموعة الضابطة التنفس القاعدي المستقر على كامل القياس وكانت متناسبة مع حجم الشريحة.
علاوة على ذلك ، كانت معدلات استهلاك الأكسجين مستقرة نسبيا لمدة خمس ساعات مع أقل من 10٪ متهدمة. تمت مقارنة كفاءة اقتران الميتوكوندريا وأظهرت الشريحة بسماكة 150 ميكرومتر وحجم اللكمة 1.5 ملم أعلى كفاءة اقتران. تم قياس معدلات استهلاك الأكسجين للمجموعات الصغيرة والكبيرة من Pink1 بالضربة القاضية والفئران من النوع البري المتطابقة مع العمر.
كان معدل استهلاك الأكسجين القاعدي مشابها في كل من المجموعات الضربة القاضية والمجموعات البرية للفئران الصغيرة. ومع ذلك ، فقد انخفض بالنسبة للفئران بالضربة القاضية في المجموعة القديمة. ومع ذلك ، لوحظ خلل الميتوكوندريا في الفئران الضربة القاضية للفئة العمرية المبكرة ، والتي يشار إليها من خلال انخفاض كفاءة الاقتران الناجمة عن خروج المغلوب من Pink1.
تتضمن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول إعداد شرائح الدماغ ونقلها إلى أعلى شاشة الالتقاط ووضع الشرائح في الآبار وإبقائها متصلة بشاشة الالتقاط أثناء القياسات.
