Desenvolvemos um novo método usando um analisador XF de cavalo marinho para medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio. Mas proxy comum para função mitocondrial em fatia de slide aguda de camundongos adultos. Este método mede um celular por energia em perfurações de estruturas cerebrais anatomicamente definidas.
O uso de fatias agudas imita mais de perto o ambiente celular fisiológico que não pode ser alcançado das formas isoladas de células mitocondriais ou culturais. Este método será de amplo interesse para pesquisadores que trabalham no campo da doença de Parkinson e da doença de Huntington. Para começar, abra o kit de ensaio de fluxo extracelular e remova o cartucho do sensor e a placa de utilidade.
Em seguida, coloque o cartucho do sensor de lado e não toque nos sensores. Em seguida, adicione 600 microliters de solução calibrada a cada parede da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor em cima da placa do utilitário e submerse os sensores na solução calibrada, garantindo que o entalhe triangular do utilitário e da placa do cartucho do sensor estejam corretamente alinhados.
Depois, sele o kit de ensaio de fluxo extracelular com filme de vedação para evitar a evaporação da solução calibrada e, em seguida, coloque-o em uma incubadora Celsius de 37 graus não suplementada com dióxido de carbono ou oxigênio, durante a noite. Abra a micro placa de captura do ilhó e tire a placa do ilhó para sentar o tecido. Em seguida, aqueça um volume apropriado de tampão de fluido espinhal cerebral artificial modificado pré-oxigenado para 37 graus Celsius em um tubo de 50 mililitros.
Em seguida, adicione BSA a uma concentração final de quatro miligramas por mililitro para preparar o tampão de respiração. Adicione 625 microliters de tampão de respiração a cada poço da placa de ilhós cuidadosamente, evitando sacudir a placa, garantindo que não haja bolhas de ar no tampão de cada poço. Disseque imediatamente o cérebro em 10 mililitros de solução de corte pré-oxigenada gelada.
Em seguida, utilizando uma seção vibratome coronal striatal fatias, seguindo a instrução do fabricante a uma espessura de 150 micrômetros em solução de corte pré-oxigenado gelado. Em seguida, recupere as fatias em 50 mililitros de fluido cerebral cerebral artificial oxigenado. E mantê-los em solução por até 30 minutos em temperatura ambiente.
Após a recuperação, transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros com cinco milímetros de tampão de respiração. O uso de um soco de biópsia de aço inoxidável cria um pedaço circular de tecido na área desejada do cérebro fatiado pressionando suavemente o soco enquanto mantém a fatia no buffer. Em seguida, remova o resto do tecido, levante o soco e remova o pedaço circular de tecido no tampão.
Em seguida, corte a extremidade de uma ponta de pipeta de um mililitro para fazer um furo com um ponto-cinco a dois pontos-zero milímetro de diâmetro e use-o para segurar e transferir a fatia perfurada para o topo da tela de captura. Sucção um pedaço de tecido cerebral perfurado e coloque cuidadosamente o tecido sobre o lado da malha da tela de captura, um pedaço circular de plástico com a malha presa a um lado. Usando um tecido de papel seque suavemente a tela de captura e remova a umidade, que permite que o tecido fique pegajoso e preso ao centro da malha.
Em seguida, segure a tela de captura de lado cortado com pinças e coloque-a em um dos poços da placa de ilhó incubadora. Em seguida, incubar a placa de ilhó a 37 graus Celsius em uma incubadora por pelo menos 30 minutos para permitir a temperatura e o equilíbrio do pH antes de executar o ensaio. Diluir os compostos desejados e modificado fluido cerebral cerebral sem BSA para a concentração final de estoque da concentração de trabalho para os portos A a D, respectivamente.
Precarreça suavemente 75 microliters dos compostos diluídos nas portas de injeção apropriadas do cartucho do sensor, colocando as pontas no meio das portas de injeção em um ângulo de 45 graus com a ponta contra a parede da porta de injeção, pois a inserção completa pode causar vazamento composto através da porta. Depois, retire cuidadosamente as pontas das portas sem criar bolhas de ar e não toque em nenhuma parte do cartucho para evitar aliviar bolhas de ar. Em seguida, inspecione visualmente as portas de injeção para mesmo carregar, garantindo que todo o líquido esteja na porta e que não haja gotas residuais em cima do cartucho.
Depois de colocar o cartucho do sensor na placa do utilitário coloque-o em uma incubadora por 30 minutos para permitir que ele aqueça até 37 graus Celsius enquanto manuseia cuidadosamente apenas segurando a placa de utilidade e movendo o mínimo possível. Primeiro carregue o modelo de ensaio no software e, em seguida, pressione o botão de partida verde. Em seguida, carregue o cartucho do sensor na placa do utilitário na bandeja do instrumento, garantindo que a placa fique correta e esteja plana, carregando o cartucho de sensor cheio de drogas no analisador para calibração.
Depois, siga as instruções na tela para calibrar. E equilibre os sensores. Uma vez feito o passo de equilíbrio, remova a placa de calibração e substitua-a pela placa de ilhó contendo as fatias de malha e tecido.
Em seguida, meça a taxa de consumo de oxigênio em cada poço da placa, usando os protocolos de ensaio descritos no manuscrito. A seguir, analise os dados de medição da taxa de consumo de oxigênio e os dados de eficiência de acoplamento. As taxas de consumo de oxigênio para diferentes espessuras e tamanhos de perfuração de fatias no grupo controle mostraram respiração basal estável ao longo de toda a medição e foram proporcionais ao volume da fatia.
Além disso, as taxas de consumo de oxigênio foram relativamente estáveis por cinco horas, com menos de 10% de retração. A eficiência do acoplamento mitocondrial foi comparada e a fatia na espessura de 150 micrômetros e um tamanho de soco de 1,5 milímetros mostraram a maior eficiência de acoplamento. As taxas de consumo de oxigênio foram medidas para grupos jovens e antigos de pink1 nocaute e seus camundongos de tipo selvagem com correspondência etária.
A taxa de consumo de oxigênio basal foi semelhante tanto nos grupos de nocaute quanto de tipo selvagem para camundongos jovens. No entanto, diminuiu para os ratos nocaute no antigo grupo. No entanto, a disfunção mitocondrial nos camundongos eliminatórios foi observada para a faixa etária jovem, indicada pela diminuição da eficiência de acoplamento causada pelo nocaute de Pink1.
As etapas críticas deste protocolo incluem preparar fatias cerebrais, transferi-las para o topo da tela de captura, colocar slides em poços e mantê-los conectados à tela de captura durante as medições.
