Oksijen tüketim oranını doğrudan ölçmek için bir denizatı XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdik. Ancak yetişkin farelerden akut slayt diliminde mitokondriyal fonksiyon için ortak proxy. Bu yöntem, anatomik olarak tanımlanmış beyin yapılarından delinmelerde enerjik bir hücreyi ölçer.
Akut dilimlerin kullanılması, izole mitokondriyal veya kültür hücrelerinin elde edilemediği fizyolojik hücresel ortamı daha yakından taklit eder. Bu yöntem, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı alanında çalışan araştırmacılar için geniş ilgi çekici olacaktır. Başlamak için, hücre dışı akı testi kitini açın ve hem sensör kartuşunu hem de yardımcı plakayı çıkarın.
Ardından sensör kartuşunu bir kenara koyun ve sensörlere dokunmayın. Ardından, yardımcı plakanın her duvarına 600 mikrolitre kalibrasyon çözeltisi ekleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakanın üzerine yerleştirin ve sensörleri kalibrasyon çözeltisine batırarak yardımcı programın ve sensör kartuşu plakasının üçgen çentiğinin doğru şekilde hizalandığından emin olun.
Daha sonra, kalibrasyon çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için hücre dışı akı testi kitini sızdırmazlık filmi ile kapatın ve daha sonra gece boyunca karbondioksit veya oksijen ile desteklenmemiş 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Delikli yakalama mikro plakasını açın ve doku oturması için delikli plakayı çıkarın. Daha sonra uygun miktarda önceden oksijenlenmiş modifiye edilmiş yapay beyin omurilik sıvısı tamponunu 50 mililitrelik bir tüpte 37 santigrat dereceye ısıtın.
Daha sonra, solunum tamponunu hazırlamak için mililitre başına dört miligramlık son bir konsantrasyona BSA ekleyin. Halkayı sallamaktan kaçınırken delikli plakanın her bir kuyucuğuna 625 mikrolitre solunum tamponu ekleyin ve her bir kuyucuğun tamponunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Beyni derhal 10 mililitre buz gibi soğuk ön oksijenli kesme çözeltisinde diseke edin.
Daha sonra, bir vibratom kesiti koronal striatal dilimler kullanarak, üreticinin talimatını buz gibi soğuk ön oksijenli kesme çözeltisinde 150 mikrometre kalınlığında takip edin. Daha sonra, dilimleri 50 mililitre oksijenli yapay beyin omurilik sıvısında geri kazanın. Ve bunları oda sıcaklığında 30 dakikaya kadar çözelti içinde saklayın.
İyileşmeden sonra, dilimleri beş milimetre solunum tamponu ile 35 x 10 milimetre Petri kabına aktarın. Paslanmaz çelik biyopsi zımba kullanarak, dilimi tamponda tutarken zımbayı hafifçe bastırarak dilimlenmiş beynin istenen bölgesinde dairesel bir doku parçası oluşturun. Ardından dokunun geri kalanını çıkarın, zımbayı kaldırın ve dairesel doku parçasını tampona çıkarın.
Ardından, bir mililitrelik pipet ucunun en ucunu keserek bir nokta beş ila iki nokta sıfır milimetre çapında bir delik açın ve delikli dilimi tutmak ve yakalama ekranının üstüne aktarmak için kullanın. Bir parça delinmiş beyin dokusunu emin ve dokuyu dikkatlice yakalama ekranının ağ tarafına, ağın bir tarafa tutturulduğu dairesel bir plastik parçasına yerleştirin. Bir kağıt mendil kullanarak yakalama ekranını nazikçe kurutun ve nemi giderin, bu da dokunun yapışkan hale gelmesini ve ağın merkezine tutturulmasını sağlar.
Ardından, yakalama ekranını cımbızla dilim tarafı aşağı doğru tutun ve kuluçka deliği plakasının kuyucuklarından birine yerleştirin. Daha sonra, tahlili çalıştırmadan önce sıcaklık ve pH dengesine izin vermek için göz kapağını bir inkübatörde 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. İstenilen bileşikleri seyreltin ve BSA olmadan modifiye edilmiş yapay beyin omurilik sıvısını, sırasıyla A'dan D'ye portlar için çalışma konsantrasyonunun son stok konsantrasyonuna getirin.
Seyreltilmiş bileşiklerin 75 mikrolitresini, uçları enjeksiyon portlarının yarısına kadar yerleştirerek, ucu enjeksiyon portunun duvarına dayalı, ucu enjeksiyon portunun duvarına dayamış olarak 45 derecelik bir açıyla sensör kartuşunun uygun enjeksiyon portlarına nazikçe önceden yükleyin, çünkü tam yerleştirme porttan bileşik sızıntısına neden olabilir. Daha sonra, hava kabarcıkları oluşturmadan uçları bağlantı noktalarından dikkatlice çekin ve hava kabarcıklarını hafifletmekten kaçınmak için kartuşun herhangi bir kısmına dokunmayın. Ardından, enjeksiyon portlarını eşit yükleme açısından görsel olarak kontrol ederek tüm sıvının portta olduğundan ve kartuşun üstünde artık damla kalmadığından emin olun.
Sensör kartuşunu yardımcı plakaya yerleştirdikten sonra, yalnızca yardımcı plakaya tutunarak ve mümkün olduğunca az hareket ettirerek dikkatli bir şekilde kullanılırken 37 santigrat dereceye kadar ısınmasını sağlamak için 30 dakika boyunca bir inkübatöre koyun. İlk önce tahlil şablonunu yazılıma yükleyin ve ardından yeşil başlat düğmesine basın. Ardından, yardımcı plakadaki sensör kartuşunu cihaz tepsisine takın, plakanın doğru oturduğundan ve düz olduğundan emin olun ve ilaç dolu sensör kartuşunu kalibrasyon için analizöre yükleyin.
Daha sonra, kalibre etmek için ekrandaki talimatları izleyin. Ve sensörleri dengeleyin. Dengeleme adımı tamamlandıktan sonra, kalibrasyon plakasını çıkarın ve ağ ve doku dilimlerini içeren delikli plaka ile değiştirin.
Daha sonra, makalede açıklandığı gibi tahlil protokollerini kullanarak plakanın her bir kuyusundaki oksijen tüketim oranını ölçün. Aşağıda, oksijen tüketim hızı ölçüm verilerini ve kaplin verimliliği verilerini analiz edin. Kontrol grubundaki dilimlerin farklı kalınlıkları ve zımba boyutları için oksijen tüketim oranları, tüm ölçüm boyunca stabil bazal solunum gösterdi ve dilimin hacmi ile orantılıydı.
Ayrıca, oksijen tüketim oranları% 10'dan az tükenme ile beş saat boyunca nispeten istikrarlıydı. Mitokondriyal bağlantı verimliliği karşılaştırıldı ve 150 mikrometre kalınlığındaki dilim ve 1,5 milimetrelik zımba boyutundaki dilim en yüksek bağlantı verimliliğini gösterdi. Oksijen tüketim oranları, genç ve yaşlı Pink1 nakavt grupları ve yaşlarına uygun vahşi tip fareler için ölçüldü.
Bazal oksijen tüketim oranı, genç fareler için hem nakavt hem de vahşi tip gruplarda benzerdi. Ancak eski gruptaki nakavt fareler için azaldı. Bununla birlikte, nakavt farelerdeki mitokondriyal disfonksiyon, Pink1'in nakavtının neden olduğu düşük bağlantı verimliliği ile gösterilen genç yaş grubu için gözlenmiştir.
Bu protokoldeki kritik adımlar, beyin dilimlerinin hazırlanmasını, bunları yakalama ekranının en üstüne aktarmayı, slaytları kuyucuklara yerleştirmeyi ve ölçümler sırasında bunları yakalama ekranına bağlı tutmayı içerir.
