우리는 해마 XF 분석기를 사용하여 산소 소모율을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 그러나 성인 마우스로부터의 급성 슬라이드 슬라이스에서 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 펑크에있는 에너지에 의해 세포를 측정합니다.
급성 슬라이스를 사용하는 것은 미토콘드리아 또는 배양 세포를 분리하는 방법을 달성할 수 없는 생리학적 세포 환경을 더 밀접하게 모방한다. 이 방법은 파킨슨 병과 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다. 시작하려면 세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 모두 제거하십시오.
그런 다음 센서 카트리지를 따로 놓고 센서를 만지지 마십시오. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 각 벽에 600 마이크로 리터의 교정 용액을 추가하십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 센서를 교정 솔루션에 잠기면 유틸리티와 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되었는지 확인합니다.
그 후, 검량액의 증발을 방지하기 위해 세포외 플럭스 분석 키트를 밀봉 필름으로 밀봉한 다음, 이산화탄소 또는 산소가 보충되지 않은 섭씨 37도 배양기에 하룻밤 동안 보관한다. 아일렛 캡처 마이크로 플레이트를 열고 조직 앉기를 위해 아일렛 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음 적절한 부피의 사전 산소화 된 변형 된 인공 뇌척수액 완충액을 50 밀리리터 튜브에서 섭씨 37도까지 따뜻하게하십시오.
다음으로 BSA를 밀리리터 당 네 밀리그램의 최종 농도에 첨가하여 호흡 완충액을 준비하십시오. 625 마이크로리터의 호흡 완충액을 아일렛 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 첨가하면서 플레이트를 흔들지 않도록 하여 각 웰의 버퍼에 기포가 존재하지 않도록 합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 사전 산소화 된 절단 용액 10 밀리리터로 뇌를 해부하십시오.
이어서, 비브라톰 섹션 코로나 스트리아탈 슬라이스를 사용하여, 얼음처럼 차가운 예비산소화 절단 용액에서 150 마이크로미터의 두께로 제조자의 지시에 따라. 다음으로, 50 밀리리터의 산소화 된 인공 뇌척수액에서 조각을 회수하십시오. 그리고 실온에서 최대 30 분 동안 용액에 보관하십시오.
회복 후, 조각을 5 밀리미터의 호흡 버퍼가있는 35 x 10 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 스테인레스 스틸 생검 펀치를 사용하여 슬라이스를 버퍼에 유지하면서 펀치를 부드럽게 눌러 슬라이스 된 뇌의 원하는 영역에 원형 조직 조각을 만듭니다. 그런 다음 나머지 조직을 제거하고 펀치를 들어 올려 원형 조직 조각을 버퍼로 제거하십시오.
그런 다음 한 밀리리터 피펫 팁의 맨 끝을 잘라 한 점 다섯 ~ 두 점 제로 밀리미터 직경의 구멍을 만들고 펀치 된 슬라이스를 잡고 캡처 화면 상단으로 옮기는 데 사용합니다. 펀치 된 뇌 조직의 한 조각을 흡입하고 조심스럽게 캡처 스크린의 메쉬 측면, 한쪽에 메쉬가 부착 된 원형 플라스틱 조각에 조직을 놓습니다. 종이 티슈를 사용하여 캡처 화면을 부드럽게 말리고 습기를 제거하여 조직이 끈적 거리고 메쉬 중앙에 부착되도록합니다.
그런 다음 캡처 화면 슬라이스를 핀셋으로 아래로 잡고 인큐베이팅 아일렛 플레이트의 웰 중 하나에 놓습니다. 그런 다음 아일렛 플레이트를 섭씨 37도에서 적어도 30분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하여 분석을 실행하기 전에 온도 및 pH 평형화를 허용한다. BSA가 없는 원하는 화합물 및 변형된 인공 뇌척수액을 포트 A 내지 D에 대한 작업 농도의 최종 스톡 농도로 각각 희석한다.
희석된 화합물 75 마이크로리터를 주입 포트의 벽에 대해 팁과 함께 45도 각도로 주입 포트 내로 반쯤 배치하여 센서 카트리지의 적절한 주입 포트에 부드럽게 예비로딩하면, 완전히 삽입하면 포트를 통한 화합물 누출이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 기포를 만들지 않고 포트에서 팁을 조심스럽게 꺼내고 카트리지의 어느 부분도 탭하지 마십시오. 그런 다음 주입 포트를 육안으로 검사하여 모든 액체가 포트에 있고 카트리지 위에 잔류 방울이 없는지 확인하십시오.
센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓은 후 30분 동안 인큐베이터에 넣어 섭씨 37도까지 가열할 수 있도록 하면서 유틸리티 플레이트를 잡고 가능한 한 적게 움직여 조심스럽게 취급합니다. 먼저 소프트웨어에 분석 템플릿을 로드한 다음 녹색 시작 버튼을 누릅니다. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 센서 카트리지를 계측기 트레이에 로드하여 플레이트가 올바르게 장착되고 평평한지 확인하고 약물로 채워진 센서 카트리지를 분석기에 로드하여 교정하십시오.
그런 다음 화면의 지시 사항을 따라 보정하십시오. 그리고 센서의 평형을 유지하십시오. 평형 단계가 완료되면 교정 플레이트를 제거하고 메쉬 및 조직 조각이 들어있는 아일렛 플레이트로 교체하십시오.
그런 다음 원고에 기재된 바와 같은 분석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 각 웰에서 산소 소모율을 측정하십시오. 다음으로, 산소 소모율 측정 데이터와 커플링 효율 데이터를 분석한다. 대조군에서 슬라이스의 상이한 두께 및 펀치 크기에 대한 산소 소모율은 전체 측정에 걸쳐 안정한 기저 호흡을 나타냈고, 슬라이스의 부피에 비례하였다.
또한, 산소 소모율은 10 % 미만의 런다운으로 다섯 시간 동안 상대적으로 안정적이었습니다. 미토콘드리아 결합 효율을 비교하였고 150 마이크로미터 두께와 1.5 밀리미터 크기의 펀치에서 슬라이스가 가장 높은 결합 효율을 보였다. 산소 소모율은 Pink1 녹아웃의 젊은 및 노인 그룹과 그들의 연령 일치 야생형 마우스에 대해 측정되었다.
기저 산소 소모율은 어린 마우스에 대한 녹아웃 및 야생형 그룹 모두에서 유사하였다. 그러나 이전 그룹의 녹아웃 마우스에 대해서는 감소하였다. 그러나, 넉아웃 마우스에서의 미토콘드리아 기능장애는 젊은 연령 그룹에 대해 관찰되었고, Pink1의 녹아웃에 의한 감소된 결합 효율에 의해 나타난다.
이 프로토콜의 중요한 단계에는 두뇌 조각을 준비하고, 캡처 화면 상단으로 전송하고, 슬라이드를 웰에 배치하고, 측정 중에 캡처 화면에 부착하는 것이 포함됩니다.
