מדידת קצב צריכת חמצן בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים

פיתחנו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את קצב צריכת החמצן. אבל פרוקסי נפוץ לתפקוד מיטוכונדריאלי בפרוסת שקופיות חריפה מעכברים בוגרים. שיטה זו מודדת תא על ידי אנרגטיים בנקבים ממבני מוח המוגדרים אנטומית.

שימוש בפרוסות חריפות מחקה באופן הדוק יותר את הסביבה התאית הפיזיולוגית שלא ניתן להשיג בדרכים שבהן מבודדים תאים מיטוכונדריאליים או תרבית. שיטה זו תעניין מאוד חוקרים העוסקים בתחום מחלת הפרקינסון ומחלת הנטינגטון. כדי להתחיל, פתח את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי והסר הן את מחסנית החיישן והן את לוחית השירות.

לאחר מכן הניחו את מחסנית החיישן בצד ואל תיגעו בחיישנים. לאחר מכן, הוסף 600 microliters של פתרון כיול לכל קיר של לוח השירות. הניחו את מחסנית החיישן על גבי לוח השירות והטביעו את החיישנים בפתרון הכיול, כדי להבטיח שהחריץ המשולש של לוחית מחסנית השירות והחיישן מיושר כהלכה.

לאחר מכן, אטמו את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאית עם סרט איטום כדי למנוע אידוי של תמיסת הכיול ולאחר מכן הניחו אותה בחממה של 37 מעלות צלזיוס ללא תוספת של פחמן דו-חמצני או חמצן, למשך הלילה. פתחו את צלחת המיקרו ללכידת העפעפיים והוציאו את צלחת העפעפיים לישיבת טישו. לאחר מכן לחמם נפח מתאים של חיץ נוזל מוחי מוחי מלאכותי שעבר חיטוי מראש ל-37 מעלות צלזיוס בצינור של 50 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף BSA לריכוז סופי של ארבעה מיליגרם למיליליטר כדי להכין את מאגר הנשימה. הוסיפו 625 מיקרוליטרים של חיץ נשימה לכל באר של צלחת העפעפיים בזהירות תוך הימנעות מטלטול הצלחת, מה שמבטיח שלא יהיו בועות אוויר במאגר של כל באר. מיד לנתח את המוח ב 10 מיליליטרים של תמיסת חיתוך קר כקרח מחומצן מראש.

לאחר מכן, באמצעות חתך ויברטום פרוסות סטריאליות קורונליות, בהתאם להוראת היצרן בעובי של 150 מיקרומטר בתמיסת חיתוך טרום-מחומצנת של קר כקרח. לאחר מכן, לשחזר את הפרוסות ב 50 מיליליטר של נוזל מוחי מלאכותי מחומצן. ולשמור אותם בתמיסה עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר ההתאוששות, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי בגודל 35 על 10 מילימטרים עם חמישה מילימטרים של חיץ נשימה. באמצעות אגרוף ביופסיה מפלדת אל-חלד יוצרים פיסת רקמה עגולה באזור הרצוי של המוח הפרוס על ידי לחיצה עדינה על האגרוף תוך שמירה על הפרוסה במאגר. לאחר מכן הסר את שאר הרקמה, הרם את האגרוף והסר את פיסת הרקמה העגולה לתוך החיץ.

לאחר מכן, חתכו את הקצה של קצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי ליצור חור בקוטר של נקודה אחת-חמש עד שתי נקודות-אפס מילימטרים והשתמשו בו כדי להחזיק ולהעביר את הפרוסה המנוקבת לחלק העליון של מסך הלכידה. ינקו חתיכה אחת של רקמת מוח מנוקבת והניחו בזהירות את הרקמה על צד הרשת של מסך הלכידה, חתיכת פלסטיק עגולה עם הרשת מחוברת לצד אחד. באמצעות רקמת נייר מייבשים בעדינות את מסך הלכידה ומסירים את הלחות, מה שמאפשר לרקמה להיות דביקה ומחוברת למרכז הרשת.

לאחר מכן, החזיקו את מסך הלכידה בצד פרוס עם פינצטה והניחו אותו באחת הבארות של צלחת העפעפיים המדגרת. לאחר מכן דגירו את צלחת העפעפיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר שיווי משקל טמפרטורה ו-pH לפני ביצוע הבדיקה. דיללו את התרכובות הרצויות ושינו נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי ללא BSA לריכוז המלאי הסופי של ריכוז העבודה עבור יציאות A עד D, בהתאמה.

טען מראש בעדינות 75 מיקרוליטרים של התרכובות המדוללות לתוך יציאות ההזרקה המתאימות של מחסנית החיישן על ידי הצבת הקצוות באמצע הדרך לתוך יציאות ההזרקה בזווית של 45 מעלות עם הקצה על קיר יציאת ההזרקה, שכן החדרה מלאה עלולה לגרום לדליפת תרכובת דרך היציאה. לאחר מכן, משכו את הקצוות מהיציאות בזהירות מבלי ליצור בועות אוויר ואל תקישו על שום חלק מהמחסנית כדי למנוע הקלה על בועות אוויר. לאחר מכן בדקו באופן חזותי את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה כדי לוודא שכל הנוזלים נמצאים ביציאה ולא נמצאות טיפות שיוריות על גבי המחסנית.

לאחר הנחת מחסנית החיישן על לוחית השירות הכניסו אותה לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להתחמם עד 37 מעלות צלזיוס תוך כדי טיפול זהיר רק על ידי אחיזה בלוח השירות ונעה מעט ככל האפשר. תחילה טען את תבנית הבדיקה בתוכנה ולאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה הירוק. לאחר מכן טען את מחסנית החיישן על לוחית השירות לתוך מגש המחוונים, וודא שהצלחת יושבת כראוי ושטוחה, ומעמיסה את מחסנית החיישן המלאה בתרופות לתוך המנתח לכיול.

לאחר מכן, בצע את ההוראות המופיעות על המסך על מנת לכייל. ולאזן את החיישנים. לאחר סיום שלב שיווי המשקל, הסר את לוחית הכיול והחלף אותה בפלטת העין המכילה את פרוסות הרשת והרקמות.

לאחר מכן מדוד את קצב צריכת החמצן בכל באר של הלוח, תוך שימוש בפרוטוקולי הבדיקה כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, נתחו את נתוני מדידת קצב צריכת החמצן ואת נתוני יעילות הצימוד. קצבי צריכת החמצן בעוביים שונים ובגדלים שונים של פרוסות בקבוצת הביקורת הראו נשימה בסיסית יציבה לאורך כל המדידה והיו פרופורציונליים לנפח הפרוסה.

יתר על כן, שיעורי צריכת החמצן היו יציבים יחסית במשך חמש שעות עם פחות מ-10% ריצה. יעילות הצימוד המיטוכונדריאלי הושוותה והפרוסה בעובי של 150 מיקרומטר וגודל אגרוף של 1.5 מילימטר הראתה את יעילות הצימוד הגבוהה ביותר. שיעורי צריכת החמצן נמדדו עבור קבוצות צעירות וותיקות של נוקאאוט פינק1 ועכברים פראיים תואמי גילם.

קצב צריכת החמצן הבסיסי היה דומה הן בקבוצות הנוקאאוט והן בקבוצות מסוג פרא עבור עכברים צעירים. עם זאת זה פחת עבור עכברי הנוקאאוט בקבוצה הישנה. עם זאת, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעכברי הנוקאאוט נצפה עבור קבוצת הגיל הצעירה, מה שמעיד על ירידה ביעילות הצימוד שנגרמה על ידי הנוקאאוט של פינק1.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה כוללים הכנת פרוסות מוח, העברתן לחלק העליון של מסך הלכידה, הנחת שקופיות לתוך בארות והשארתן מחוברות למסך הלכידה במהלך המדידות.