Protokolümüz, geleneksel bir floresan mikroskobu kullanarak çok hücreli sferoidlerin oksijenasyonunun görüntülenmesine yardımcı olur. Bu yöntemi kullanarak, binlerce oksijen probu lekeli küresel mikrodoku üretilebilir ve daha sonra bunları 3D baskı uygulamalarında kullanabilirsiniz. Örneğin, vaskülarize kemik dokusu greftleri.
Yakın kızılötesi oksijen probu, yeşil floresan boyama gibi diğer boyaların kullanımıyla uyumludur Sonuçta, bu canlı ve çok parametreli uzun vadeli analizlere izin verir. Mikro desenli PDMS pullarını bir saklama şişesinden steril bir Petri kabına aktarın ve steril laminer hava akımı koşulları altında pürüzsüz yüzeyle 10 dakika boyunca hava ile kurutun. Her damgayı 12 delikli steril doku kültürü plakasının kuyusunun ortasına koyun.
Açık kapakla bir ila iki dakika hava ile kurutun. 50 mililitre% 3 homojen agaroz çözeltisi hazırlayın ve yerleştirilen PDMS damgasını örtmek için 12 delikli plakaların her bir kuyucuğuna hemen yaklaşık iki mililitre sıcak agaroz çözeltisi ekleyin. Agarozu steril hava akımı altında inkübe ederek 20 dakika boyunca katılaştırın.
Steril bir spatula kullanarak, agarozu gömülü PDMS damgasıyla her bir kuyucukta baş aşağı çevirin. Damganın pürüzsüz üst tarafına yaklaşık 200 mikrolitre steril su ekleyin. Bir spatula ile agarozdan ayırın ve kuyudan çıkarın.
Doğrudan kullanım için agaroz pullarına bir mililitre karşılık gelen steril hücre kültürü ortamı ekleyin. Plakayı kapakla örtün ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kullanmadan önce, agaroz mikro desenli plakaları bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede bir saat ısıtın.
Önceden ısıtılmış PBS ile% 70 ila% 90 birleşimli hücre kültürünü durulayın. Ayrıştırıcı enzim çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. Daha sonra,% 10FBS içeren tam hücre kültürü ortamı ile tripsini nötralize edin.
Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için, serolojik pipetin üstündeki 1.000 mikrolitrelik pipet ucunu kullanarak hücre agregalarını ayrıştırın. Bir sayma odası kullanarak, hücre süspansiyonunun mililitresi başına düşen hücre sayısını sayın. Hücre süspansiyonunu mililitre başına 500.000 hücreye seyreltin ve buna konsantre oksijen probu çözeltisi ekleyin.
Eski ortamları, 12 delikli agaroz kaplı hücre kültürü plakasının mikro desenli kuyucuklarından çıkarın ve hazırlanan hücre süspansiyonunun bir mililitresini kuyucuklara ekleyin. Sferoidleri, küresel oluşum ve sıkıştırma sırasında yüklenmesini sağlamak için oksijen probunun sürekli varlığında iki ila beş gün boyunca bir karbondioksit inkübatöründe kültüre alın. Steril üç santimetreküp kartuşun ucunu uç kapağıyla kapatın ve pipetle çekerek biyo mürekkeple doldurun.
Kartuşa bir piston takın ve baş aşağı tutun. Uç kapağını çıkarın ve kartuştaki tüm hava giderilene kadar pistonu bio mürekkebe doğru itin. Biyo mürekkebi biyoyazıcının ısıtma mantosunda 23 santigrat derecede soğutun.
Biyoyazıcıya% 70 etanol püskürtün ve emici kağıtla kurulayın. Kartuşun üstündeki basınç adaptörünü vidalayın. Kartuş üzerine 22 gauge konik polietilen iğne takın.
Kartuşu, ekstrüzyon tabanlı yazıcı kafasındaki ısıtma mantosuna takın. Basınç girişini takın ve girişteki klipsi açın. Tasarımınızın G kodu dosyasını baskı yazılımına yükleyin.
İğne uzunluğu ölçümüne başlayın. Steril bir Petri kabına biraz biyo mürekkep dağıtarak baskı basıncını düzenleyin. Altı delikli bir plaka takın, kuyu plakasını açın, davlumbazın kapağını kapatın ve yazdırın.
Baskıdan sonra, iskelelerin beş santigrat derecede 10 dakika boyunca fiziksel olarak çapraz bağlanmasına izin verin. Baskılı iskeleleri ultraviyole LED lamba ile 60 saniye boyunca ışınlayın. Çift antibiyotik çözeltisi içeren ilgili büyüme ortamını derhal biyobaskılı ızgaralara sahip tüm kuyucuklara ekleyin.
İskeleleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin. Mikroskopi gözlemi için, basılı bir waffle ızgarasını görüntüleme ortamına sahip bir mikroskopi kabı kapağına aktarın. Bir mililitrelik pipet kullanarak, oksijen probu önceden boyanmış sferoidleri agaroz mikro kuyucuklarından nazikçe yıkayın ve bunları 15 mililitrelik konik alt tüpe aktarın.
Tüm sferoidlerin mikro desenli bir kuyudan toplanmasını sağlamak için, kuyuyu ek bir mililitre kültür ortamı ile bir ila üç kez durulayın ve tüm küresel süspansiyonları tek bir şişede birleştirin. Sferoidlerin dibe yerleşmesine izin vermek için şişeyi 10 dakikaya kadar dikey bırakın. Medyayı tüpten dikkatlice çıkarın ve sferoidleri rahatsız etmeden bırakın.
Örnek tabak başına en az 20 sferoid için yeterli olacak taze bir kültür ortamı ekleyin ve pipetleme ile sferoidleri nazikçe askıya alın. Önceden kaplanmış her mikroskopi kuyusuna hemen eşit miktarda sferoid süspansiyon ekleyin. Mikroskopinin yüzeyine iyice yapışması için sferoidleri 37 santigrat derecede bir saat bekletin.
Ortamı mikroskopiden iyice çıkarın ve görüntüleme ortamıyla bir kez durulayın. Örneğe tam görüntüleme ortamı miktarını ekleyin. Mikroskopi aşamasında lekeli sferoidlerle mikroskopiyi ayarlayın.
10X büyütme hedefini kullanarak numuneyi iletim ışığında önizleyin. Sferoidlere ön odaklanma yapın, onları görüntünün ortasına yerleştirin ve gerekli yüksek büyütme ile hedefi çalışma pozisyonuna getirin. Küreselin ekvator kesitinde iletim ışık moduna odaklanın.
Oksijen probunun referans ve hassas spektral kanallarının floresan veya fosforesans sinyallerini toplamak için ayarları yapın ve görüntüleme işlemini başlatın. Referans ve hassas spektral kanallardan oksijen probu yoğunluk verilerini içeren vsi dosyasını birleştirilmiş modda açın. Hesaplama menüsünden oran analizi işlev penceresini açın.
Referans kanalının yoğunluğunu pay olarak ve hassas kanalın yoğunluğunu R hesaplaması için payda olarak seçin. Oran analizi penceresinde, birleştirilmiş yoğunluk görüntüsünden arka planı çıkarmak için her spektral kanala karşılık gelen yoğunluk eşiği ayarlarını uygulayın. Küresel görüntülere uygulanan ROI maskeleri, küresel sınırları belirler.
Görüntü arka planı eşit şekilde siyah olana kadar eşik değerlerini artırın. Oran analizi penceresinde, önizleme görüntüsü R gradyanının istenen çözünürlüğünü sağlayana kadar ölçekleme faktörünü oran görüntüsüne ayarlayın. Yoğunluk oranı dağılımının görüntüsü, orijinal çok kanallı görüntüye bir katman olarak eklenir.
Çok kanallı görüntünün penceresinde, katmanı yanlış bir renk çubuğuyla etkinleştirin. Görüntü ayarlama penceresindeki sabit ölçeklendirme seçeneğini kullanarak bir oran dağılımı histogramının bağlama ve bağlantıyı kaldırma sınırlarını el ile belirleyin. Sferoidlerin ilgili iletim ışığı görüntüsünü açın.
Doğrusal cetvel fonksiyonunu seçin ve sferoidlerin çapını ölçün. Verileri elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın. Gerekli boyut ve şeklin yatırım getirisini seçin ve sferoidin periferik ve hipoksik çekirdeğine uygulayın.
Seçilen YG içindeki ortalama R'yi analiz etmek için YG'yi ölçüm nesnesine dönüştürün. Verileri elektronik tablo uyumlu tablo biçiminde dışa aktarın. Daha fazla hesaplama ve istatistiksel karşılaştırma yapmak için sferoid çapların RC ve RP veri kümesini elde etmek için sferoidlerin her mikroskopi bölümüne ölçümler uygulayın.
Tüm verileri tek bir elektronik tablo dosyasında birleştirin. MMIR1 probu düşük fotobeyazlatmaya sahiptir ve hDPSC sferoidlerinde farklı mitokondri uyaranlarına hızlı solunum yanıtının gerçek zamanlı çalışması için uygundur. FCCP, bazı bölgelerde sadece hafif bir ayrılma etkisi gösterdi ve daha sonra hücre solunumunu hafifçe azalttı.
Öte yandan, rotenon, sferoid reoksijenasyona ve stimülasyondan yaklaşık 80 saniye sonra periferi-çekirdek oksijen gradyanlarının dağılmasına yol açan solunumu güçlü bir şekilde inhibe etti. Görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan pikselden piksele yoğunluk oranı hesaplamalarının otomatik protokolü kullanılarak, tüm küresel tiplerde gerçek zamanlı olarak tespit edilen çevreden çekirdeğe oksijen gradyanları, merkezdeki oksijenli çevre ve hipoksik nişler ile görselleştirilir. Buradaki grafikler, farklı sferoid tipleri için ekvator sferoid kesitlerinin oran profillerini göstermektedir.
Homosellüler hDPSC sferoidleri ile karşılaştırıldığında, heterosellüler hDPSC ila HUVEC sferoidleri anlamlı derecede daha dik gradyanlara sahipti. Heterosellüler sferoidlerdeki periferi-çekirdeğe oksijen gradyanı, güçlü solunum aktivitesine sahip hDPSC sferoidlerinin oksijenasyonuna göre bileşimlerinde hDPSC tarafından üretilir. Grafikler, biyobaskılı hDPSC sferoidlerinin, biyobaskıdan önce ölçülen sferoidlerden önemli ölçüde oksijenli bir çevreye sahip olduğunu, çekirdek oksijenasyonlarının benzer değerlere sahip olduğunu göstermektedir.
Ara sıra prob çökeltmesi düzgün sferoid oluşumunu bozarsa, prob çözeltisini kullanmadan önce yüksek hızda filtreleyin veya santrifüj edin. İğne uzunluğu ölçümünün ve basınç regülasyonunun düzeltilmesi, gözenekli bir iskeledeki biyobaskı hızına ve dikme çapına ve biyobaskı mikro agregalarına uymak için gerekli adımlardır. Prob fotostabilitesi üzerindeki etkilerini göz önünde bulundurarak oksijene duyarlı prob görüntüleme için mikroskopi ayarlarını seçin.
Oksijen görüntüleme, birçok canlı mikroskopi ölçümü ile uyumludur. Görüntülemeden sonra, immünofloresan yapabilir, Batı lekelenmesi için proteinleri ekstrakte edebilir veya gen ekspresyon analizi yapabilir.
