我们的实验方案有助于使用传统的荧光显微镜对多细胞球体的氧合进行成像。使用这种方法，人们可以生产数千个氧探针染色的球体微组织，并随后在3D打印应用中使用它们。例如，血管化骨组织移植物。
近红外氧探头与使用其他染料如绿色荧光染色等最终相容，这允许进行活的和多参数的长期分析。将微图案的PDMS印章从储存小瓶转移到无菌培养皿中，并在无菌层流气流条件下用光滑的表面风干10分钟。将每个印章放在12孔无菌组织培养板的孔中间。
打开盖子风干一到两分钟。制备50毫升3%均质琼脂糖溶液，并立即向12孔板的每个孔中加入约两毫升热琼脂糖溶液，以覆盖插入的PDMS印章。通过在无菌气流下孵育琼脂糖来固化琼脂糖20分钟。
使用无菌刮刀，将嵌入的PDMS印章的琼脂糖倒置在每个孔中。在邮票光滑的顶部加入约200微升的无菌水。用刮刀将其从琼脂糖中分离出来，然后将其从井中取出。
将一毫升相应的无菌细胞培养基加入琼脂糖印章中，直接使用。用盖子盖住盘子，在四摄氏度下孵育过夜。使用前，在二氧化碳培养箱中以37摄氏度加热琼脂糖微图案板一小时。
用预热的PBS冲洗70%至90%汇合细胞培养物。加入解离酶溶液，在37摄氏度下孵育三至五分钟。之后，用含有10%FBS的全细胞培养基中和胰蛋白酶。
为了获得单细胞悬浮液，使用血清学移液器顶部的1， 000微升移液器尖端解离细胞聚集体。使用计数室，计数每毫升细胞悬浮液的细胞数。将细胞悬浮液稀释至每毫升500， 000个细胞，并向其加入浓缩的氧探针溶液。
从12孔琼脂糖包被的细胞培养板的微图案孔中除去旧培养基，并向孔中加入一毫升制备的细胞悬浮液。在氧气探针的连续存在下，在二氧化碳培养箱中培养球体两到五天，以确保其在球体形成和压实过程中加载。用吸头盖关闭无菌三立方厘米墨盒的末端，并通过移液填充生物墨水。
将柱塞插入墨盒并将其倒置。取下吸头盖，将柱塞推向生物墨水，直到滤芯中的所有空气都被清除。将生物墨水在生物打印机的加热地幔中冷却到23摄氏度。
用70%乙醇喷洒生物打印机，并用吸收纸干燥。拧入墨盒顶部的压力适配器。在墨盒上安装一个 22 号锥形聚乙烯针。
将墨盒安装在基于挤出的打印头上的加热套管中。堵塞压力入口并打开入口上的夹子。将设计的 G 代码文件加载到打印软件中。
开始测量针的长度。通过在无菌培养皿中分配少量生物墨水来调节印刷压力。安装一个六孔板，打开孔板，关闭罩并打印。
打印后，让脚手架在5摄氏度下物理交联10分钟。用紫外线LED灯照射打印的脚手架60秒。立即将含有双抗生素溶液的相应生长培养基添加到具有生物打印网格的所有孔中。
在二氧化碳培养箱中以37摄氏度培养支架。对于显微镜观察，将印刷的华夫饼网格转移到带有成像介质的显微镜盘盖中。使用一毫升移液器，轻轻地从琼脂糖微孔中洗出氧探针预染色的球体，并将其转移到15毫升锥形底管中。
为了确保从微图案孔中收集所有球体，用额外的一毫升培养基冲洗孔一到三次，并将所有球体悬浮液混合在一个小瓶中。将小瓶垂直放置长达10分钟，让球体在底部沉降。小心地从管中取出介质，使球体不受干扰。
加入一个新鲜的培养基，每个样品培养皿至少需要20个球体，并通过移液轻轻地重悬球体。立即向每个预涂覆的显微镜孔中加入等体积的球状悬浮液。将球体在37摄氏度下放置一小时，以附着在显微镜孔的表面。
从显微镜中取出培养基，并用成像培养基冲洗一次。向样品中加入准确量的成像培养基。在显微镜载物台上用染色的球体设置显微镜孔。
使用10X放大倍率物镜，在透射光下预览样品。对球体进行初步聚焦，将它们定位在图像的中心，并将具有所需高放大倍率的物镜带到工作位置。专注于球体赤道横截面的透射光模式。
调整用于收集参考和氧探针的灵敏光谱通道的荧光或磷光信号的设置，并开始成像过程。在合并模式下打开带有来自参考通道和敏感光谱通道的氧探头强度数据的 vsi 文件。从测量菜单打开比率分析功能窗口。
选择参考通道的强度作为分子，选择敏感通道的强度作为 R 计算的分母。在比率分析窗口中，将相应的强度阈值设置应用于每个光谱通道，以从合并的强度图像中减去背景。应用于旋转椭球体图像的 ROI 掩码可确定球体边界。
增加阈值，直到图像背景均匀变黑。在比率分析窗口中，调整比例因子与比率图像，直到预览图像提供所需的 R 渐变分辨率。强度比分布的图像作为图层添加到原始多通道图像中。
在多通道图像的窗口中，使用假色条激活图层。使用调整显示窗口中的固定缩放选项手动确定比率分布直方图的链接和取消链接限制。打开球体的相应透射光图像。
选择线性标尺函数并测量球体的直径。将数据导出为电子表格表文件。选择所需尺寸和形状的ROI，并将其应用于球体的外围和缺氧核心。
将 ROI 转换为测量对象，以分析所选 ROI 内的平均 R。以电子表格兼容的表格格式导出数据。将测量值应用于球体的每个显微镜部分，以获得球体直径RC和RP的数据集，以执行进一步的计算和统计比较。
将所有数据合并到一个电子表格文件中。MMIR1探针具有低光漂白性，适用于hDPSC球体对不同线粒体刺激的快速呼吸反应的实时研究。FCCP在某些区域仅显示出轻微的解偶作用，然后细胞呼吸略有下降。
另一方面，鱼藤酮强烈抑制呼吸，导致球体再氧合，并在刺激后约80秒内消散外围至核心氧梯度。使用成像软件提供的像素比自动计算方案，以含氧外围和缺氧壁龛为中心，实时检测所有球体类型的外围至核心氧梯度。这里的图表描述了不同球体类型的赤道球体横截面的比率图。
与同细胞hDPSC球体相比，异细胞hDPSC至HUVEC球体具有明显更陡峭的梯度。异细胞球体中的外围至核心氧梯度可能是由hDPSC根据其组成产生的，根据hDPSC球体氧合具有很强的呼吸活性。这些图表明，生物打印的hDPSC球体比生物打印前测量的球体具有显着的氧化外围，而它们的核心氧合具有相似的值。
如果偶尔的探针沉淀干扰均匀的球体形成，请在使用前高速过滤或对探针溶液进行离心。校正针长度测量和压力调节是匹配多孔支架中生物打印速率和支柱直径以及生物打印微聚集体的重要步骤。选择氧敏探针成像的显微镜设置，考虑它们对探针光稳定性的影响。
氧气成像与许多类型的实时显微镜测量兼容。成像后，还可以进行免疫荧光，提取蛋白质进行蛋白质免疫印迹，或进行基因表达分析。
