Nosso protocolo ajuda a oxigenação de imagens de esferoides multicelulares usando um microscópio de fluorescência convencional. Usando este método, pode-se produzir milhares de microtissues esferoides manchados de sonda de oxigênio e, posteriormente, usá-los em aplicações de impressão 3D. Por exemplo, enxertos vascularizados de tecido ósseo.
sonda de oxigênio infravermelho próximo é compatível com o uso de outros corantes, como a coloração de fluorescência verde de Ultimately, isso permite análises ao vivo e multi-parâmetros a longo prazo. Transfira selos PDMS micro-padronizados de um frasco de armazenamento para uma placa de Petri estéril e ar seco com a superfície lisa sob as condições estéreis de fluxo de ar laminar por 10 minutos. Coloque cada carimbo no meio do poço de uma placa de cultura de tecido estéril de 12 poços.
A seco por um a dois minutos com uma tampa aberta. Prepare 50 mililitros de solução agarose 3% homogênea e adicione imediatamente aproximadamente dois mililitros de solução de agarose quente a cada poço das placas de 12 poços para cobrir o selo PDMS inserido. Solidifique a agarose por 20 minutos incubando-a sob fluxo de ar estéril.
Usando uma espátula estéril, gire a agarose com o selo PDMS embutido de cabeça para baixo em cada poço. Adicione aproximadamente 200 microliters de água estéril na parte superior lisa do selo. Desprender-o da agarose com uma espátula e removê-lo do poço.
Adicione um mililitro de mídia de cultura celular estéril correspondente aos selos agarose para uso direto. Cubra a placa com a tampa e incuba durante a noite a quatro graus Celsius. Antes do uso, aqueça as placas micro-padronizadas da ágarose por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.
Enxágüe de 70% a 90% de cultura celular de confluência com PBS pré-aquecido. Adicione a solução dissociante da enzima e incubar por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Mais tarde, neutralize a trippsina com mídia completa de cultura celular contendo 10% FBS.
Para obter uma única suspensão celular, dissociar agregados celulares usando uma ponta de pipeta de 1.000 microliter na parte superior da pipeta sorológica. Usando uma câmara de contagem, conte o número de células por mililitro da suspensão celular. Diluir a suspensão celular para 500.000 células por mililitro e adicionar solução concentrada de sonda de oxigênio a ele.
Remova a mídia antiga dos poços micro-padronizados da placa de cultura celular revestida de 12 poços e adicione um mililitro da suspensão celular preparada aos poços. Cultura os esferoides em uma incubadora de dióxido de carbono por dois a cinco dias na presença contínua da sonda de oxigênio para garantir que ele está carregando durante a formação e compactação de spheroid. Feche a extremidade de um cartucho de três centímetros cúbicos estérei com uma tampa de ponta e encha com tinta biológica por pipetação.
Insira um êmbolo no cartucho e segure-o de cabeça para baixo. Retire a tampa da ponta e empurre o êmbolo em direção à tinta biológica até que todo o ar do cartucho seja removido. Esfrie a tinta biológica no manto de aquecimento da bioimpressora a 23 graus Celsius.
Pulverize a bioimpressora com 70% de etanol e seque-a com papel absorvente. Aparafusar em um adaptador de pressão na parte superior do cartucho. Monte uma agulha de polietileno cônica de calibre 22 no cartucho.
Instale o cartucho no manto de aquecimento na cabeça de impressão baseada em extrusão. Conecte a entrada de pressão e abra o clipe na entrada. Carregue o arquivo de código G do seu design no software de impressão.
Inicie a medição do comprimento da agulha. Regular a pressão de impressão distribuindo um pouco de tinta biológica em uma placa de Petri estéril. Instale uma placa de seis poços, abra a placa do poço, feche o capô e imprima.
Após a impressão, deixe os andaimes serem fisicamente cruzados por 10 minutos a cinco graus Celsius. Irradie os andaimes impressos por 60 segundos com uma lâmpada LED ultravioleta. Adicione imediatamente a mídia de crescimento correspondente contendo solução de antibiótico duplo a todos os poços com grades bioimpressoras.
Cultura os andaimes a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Para observação de microscopia, transfira uma grade de waffle impressa para uma capa de prato de microscopia com mídia de imagem. Usando uma pipeta de um mililitro, lave suavemente os esferoides pré-manchados da sonda de oxigênio dos micro poços agarose e transfira-os para um tubo de fundo cônico de 15 mililitros.
Para garantir a coleta de todos os esferoides de um poço micro-padronizado, enxágue o poço uma a três vezes com o mililitro adicional de mídia cultural e combine todas as suspensões esferoides em um frasco. Deixe o frasco vertical por até 10 minutos para deixar os spheróides se acalmarem na parte inferior. Remova cuidadosamente a mídia do tubo deixando os esferoides imperturbáveis.
Adicione um meio de cultura fresco que será suficiente para pelo menos 20 esferoides por prato de amostra e resuspenda suavemente os esferoides por pipetação. Adicione imediatamente um volume igual de suspensão esferoide a cada poço de microscopia pré-revestida. Deixe os esferoides por uma hora a 37 graus Celsius para anexar à superfície do poço de microscopia.
Remova o meio da microscopia e enxágue uma vez com mídia de imagem. Adicione a quantidade exata de mídia de imagem à amostra. Configure bem a microscopia com esferoides manchados no estágio de microscopia.
Utilizando o objetivo de ampliação de 10X, visualize a amostra em luz de transmissão. Faça o foco preliminar em esferoides, localize-os no centro da imagem e traga o objetivo com a alta ampliação necessária para a posição de trabalho. Concentre-se no modo de luz de transmissão na seção transversal equatorial do esferoide.
Ajuste as configurações para coletar sinais de fluorescência ou fosforescência de canais espectrais sensíveis da sonda de oxigênio e inicie o processo de imagem. Abra o arquivo vsi com dados de intensidade da sonda de oxigênio a partir de canais espectrais sensíveis e de referência no modo mesclado. Abra a janela da função de análise de proporções do menu de medida.
Escolha a intensidade do canal de referência como o numerador e a intensidade do canal sensível como um denominador para o cálculo R. Na janela de análise de razão, aplique configurações correspondentes de limiar de intensidade em cada canal espectral para subtrair o fundo da imagem de intensidade mesclada. Máscaras de ROI aplicadas a imagens esferoides determinam as bordas eferóides.
Aumente os valores de limiar até que o fundo da imagem seja uniformemente preto. Na janela de análise de razão, ajuste o fator de escala para a imagem de razão até que a imagem de visualização forneça a resolução desejada do gradiente R. A imagem da distribuição da razão de intensidade é adicionada como uma camada à imagem multicanal original.
Na janela da imagem multicanal, ative a camada com uma barra de cor falsa. Determine manualmente os limites de vinculação e desvinculação de um histograma de distribuição de proporções usando a opção de dimensionamento fixo na janela de exibição de ajuste. Abra a imagem de luz de transmissão correspondente dos esferoides.
Escolha a função de régua linear e meça o diâmetro dos esferoides. Exportar dados como um arquivo de tabela de planilha. Escolha o ROI do tamanho e forma necessários e aplique-o no núcleo periférico e hipóxico do esferoide.
Transforme o ROI no objeto de medição para analisar o R médio dentro do ROI escolhido. Exportar dados em um formato de tabela compatível com planilha. Aplique medições em cada seção de microscopia de esferoides para obter o conjunto de dados dos diâmetros esferoides RC e RP para realizar mais cálculos e comparação estatística.
Combine todos os dados em um arquivo de planilha. A sonda MMIR1 tem baixa fotobleaching e é adequada para estudo em tempo real de resposta respiratória rápida em esferoides hDPSC para diferentes estímulos mitocôndrias. O FCCP apresentou apenas um leve efeito de desacoplamento em algumas áreas e, em seguida, diminuiu ligeiramente a respiração celular.
Por outro lado, rotenona inibiu fortemente a respiração levando à reoxigenação esceróide e à dissipação dos gradientes de oxigênio periférico-núcleo dentro de aproximadamente 80 segundos após a estimulação. Usando o protocolo automatizado de cálculos de proporção de intensidade de pixel por pixel fornecidos pelo software de imagem, gradientes de oxigênio desaferentes de periféricos e núcleo detectados em tempo real em todos os tipos de esferoides são visualizados com os nichos de periferia e hipoxicos oxigenados no centro. Os gráficos aqui descritos retratam perfis de proporção das seções transversais esferoides equatoriais para diferentes tipos de esferoides.
Em comparação com os esferoides hDPSC homocelulares, os spheróides heterocelulares hDPSC para os sferóides HUVEC tinham gradientes significativamente mais íngremes. O gradiente de oxigênio periférico-núcleo em esferoides heterocelulares é provavelmente gerado por hDPSC em sua composição de acordo com a oxigenação de spheroids hDPSC com forte atividade respiratória. Os gráficos mostram que os esferoides hDPSC bioimpressos tinham uma periferia significativamente oxigenada do que os esferoides medidos antes da bioimpressão, enquanto sua oxigenação central tinha valores semelhantes.
Se a precipitação ocasional da sonda perturbar a formação uniforme de spheroid, filtrar ou centrifugar a solução da sonda em alta velocidade antes do uso. A correção da medição do comprimento da agulha e a regulação da pressão são etapas essenciais para corresponder à taxa de bioimpressão e ao diâmetro do suporte e microagressões de bioimpressão em um andaime poroso. Escolha as configurações de microscopia para imagens de sondas sensíveis ao oxigênio, considerando seu efeito na fotoestabilidade da sonda.
A imagem de oxigênio é compatível com muitos tipos de medições de microscopia ao vivo. Após a imagem, também pode-se realizar imunofluorescência, extrair proteínas para manchas ocidentais ou realizar análises de expressão genética.
