Il nostro protocollo aiuta l'imaging dell'ossigenazione di sferoidi multicellulari utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale. Usando questo metodo, si possono produrre migliaia di microtessuti sferoidi colorati con sonda di ossigeno e successivamente utilizzarli in applicazioni di stampa 3D. Ad esempio, innesti di tessuto osseo vascolarizzato.
la sonda di ossigeno nel vicino infrarosso è compatibile con l'uso di altri coloranti come la colorazione a fluorescenza verde di Ultimately, questo consente un'analisi a lungo termine viva e multiparametrica. Trasferire i timbri PDMS micro-modellati da una fiala di stoccaggio a una capsula di Petri sterile e asciugare all'aria con la superficie liscia fino alle condizioni di flusso d'aria laminare sterile per 10 minuti. Metti ogni timbro nel mezzo del pozzo di una piastra di coltura tissutale sterile a 12 pozzetti.
Asciugare all'aria per uno o due minuti con un coperchio aperto. Preparare 50 millilitri di soluzione di agarosio omogenea al 3% e aggiungere immediatamente circa due millilitri di soluzione di agarosio caldo a ciascun pozzetto delle piastre a 12 pozzetti per coprire il timbro PDMS inserito. Solidificare l'agarosio per 20 minuti incubandolo sotto flusso d'aria sterile.
Usando una spatola sterile, capovolgere l'agarosio con il timbro PDMS incorporato in ogni pozzetto. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua sterile sul lato superiore liscio del timbro. Staccarlo dall'agarosio con una spatola e rimuoverlo dal pozzo.
Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare sterile corrispondente ai timbri di agarosio per l'uso diretto. Coprire la piastra con il coperchio e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Prima dell'uso, riscaldare le piastre micro-modellate di agarosio per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica.
Risciacquare la coltura cellulare di confluenza dal 70% al 90% con PBS preriscaldato. Aggiungere la soluzione enzimatica dissociante e incubare per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, neutralizzare la tripsina con terreni di coltura cellulare completi contenenti il 10% di FBS.
Per ottenere una sospensione a singola cellula, dissociare gli aggregati cellulari utilizzando una punta di pipetta da 1.000 microlitri sulla parte superiore della pipetta sierologica. Utilizzando una camera di conteggio, contare il numero di celle per millilitro della sospensione cellulare. Diluire la sospensione cellulare a 500.000 cellule per millilitro e aggiungere una soluzione concentrata di sonda di ossigeno.
Rimuovere i vecchi mezzi dai pozzetti micro-modellati della piastra di coltura cellulare rivestita di agarosio a 12 pozzetti e aggiungere un millilitro della sospensione cellulare preparata ai pozzetti. Coltivare gli sferoidi in un incubatore di anidride carbonica per due-cinque giorni in presenza continua della sonda di ossigeno per garantire che sia caricata durante la formazione e la compattazione degli sferoidi. Chiudere l'estremità di una cartuccia sterile di tre centimetri cubici con un tappo a punta e riempire con inchiostro bio mediante pipettaggio.
Inserire uno stantuffo nella cartuccia e tenerlo a testa in giù. Rimuovere il tappo della punta e spingere lo stantuffo verso l'inchiostro bio fino a rimuovere tutta l'aria dalla cartuccia. Raffreddare l'inchiostro bio nel mantello riscaldante della bioprinter a 23 gradi Celsius.
Spruzzare la bioprinter con etanolo al 70% e asciugarla con carta assorbente. Avvitare un adattatore di pressione sulla parte superiore della cartuccia. Montare un ago in polietilene conico calibro 22 sulla cartuccia.
Installare la cartuccia nel mantello riscaldante sulla testina di stampa basata sull'estrusione. Collegare l'ingresso di pressione e aprire la clip sull'ingresso. Caricare il file G-code del progetto nel software di stampa.
Iniziare la misurazione della lunghezza dell'ago. Regolare la pressione di stampa erogando un po' di inchiostro bio in una capsula di Petri sterile. Installare una piastra a sei pozzetti, aprire la piastra del pozzo, chiudere il cappuccio e stampare.
Dopo la stampa, lasciare che le impalcature siano fisicamente reticolate per 10 minuti a cinque gradi Celsius. Irradiare gli scaffold stampati per 60 secondi con una lampada a LED ultravioletta. Aggiungere immediatamente il mezzo di crescita corrispondente contenente doppia soluzione antibiotica a tutti i pozzetti con griglie biostampate.
Coltiva le impalcature a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Per l'osservazione al microscopio, trasferire una griglia di waffle stampata in una copertura per microscopia con supporti di imaging. Utilizzando una pipetta da un millilitro, lavare delicatamente gli sferoidi pre-macchiati della sonda di ossigeno dai micro pozzetti di agarosio e trasferirli in un tubo inferiore conico da 15 millilitri.
Per garantire la raccolta di tutti gli sferoidi da un pozzo micro-modellato, sciacquare il pozzetto da una a tre volte con l'ulteriore millilitro di terreno di coltura e combinare tutte le sospensioni sferoidi in un'unica fiala. Lasciare il flaconcino verticale per un massimo di 10 minuti per lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo. Rimuovere con cura il fluido dal tubo lasciando indisturbati gli sferoidi.
Aggiungere un terreno di coltura fresco che sarà sufficiente per almeno 20 sferoidi per piatto campione e risospesciare delicatamente gli sferoidi mediante pipettaggio. Aggiungere immediatamente un volume uguale di sospensione sferoide a ciascun pozzetto di microscopia pre-rivestito. Lasciare gli sferoidi per un'ora a 37 gradi Celsius per attaccarli bene alla superficie della microscopia.
Rimuovere bene il mezzo dalla microscopia e risciacquare una volta con un mezzo di imaging. Aggiungere la quantità esatta di supporti di imaging al campione. Impostare bene la microscopia con sferoidi colorati sul palco della microscopia.
Utilizzando l'obiettivo di ingrandimento 10X, visualizzare in anteprima il campione nella luce di trasmissione. Fai una messa a fuoco preliminare sugli sferoidi, posizionali al centro dell'immagine e porta l'obiettivo con l'ingrandimento elevato richiesto nella posizione di lavoro. Focus sulla modalità di trasmissione della luce nella sezione trasversale equatoriale dello sferoide.
Regolare le impostazioni per la raccolta dei segnali di fluorescenza o fosforescenza dei canali spettrali di riferimento e sensibili della sonda di ossigeno e avviare il processo di imaging. Aprire il file vsi con i dati di intensità della sonda di ossigeno dai canali spettrali di riferimento e sensibili in modalità unita. Aprire la finestra della funzione di analisi del rapporto dal menu misura.
Scegliete l'intensità del canale di riferimento come numeratore e l'intensità del canale sensibile come denominatore per il calcolo di R. Nella finestra analisi del rapporto, applicate le impostazioni di soglia di intensità corrispondenti a ciascun canale spettrale per sottrarre lo sfondo dall'immagine di intensità unita. Le maschere ROI applicate alle immagini sferoidali determinano i bordi sferoidi.
Aumentare i valori di soglia fino a quando lo sfondo dell'immagine non è uniformemente nero. Nella finestra analisi del rapporto, regolate il fattore di scala sull'immagine del rapporto fino a quando l'immagine di anteprima non fornisce la risoluzione desiderata della sfumatura R. L'immagine della distribuzione del rapporto di intensità viene aggiunta come livello all'immagine multicanale originale.
Nella finestra dell'immagine multicanale, attivate il livello con una barra di falsi colori. Determinare manualmente i limiti di collegamento e scollegamento di un istogramma di distribuzione del rapporto utilizzando l'opzione di ridimensionamento fisso nella finestra di regolazione dello schermo. Aprire l'immagine della luce di trasmissione corrispondente degli sferoidi.
Scegliete la funzione righello lineare e misurate il diametro degli sferoidi. Esportare i dati come file di tabella del foglio di calcolo. Scegli il ROI della dimensione e della forma richieste e applicalo alla periferia e al nucleo ipossico dello sferoide.
Trasforma il ROI nell'oggetto di misura per analizzare la R media all'interno del ROI scelto. Esporta i dati in un formato di tabella compatibile con un foglio di calcolo. Applicare misurazioni a ciascuna sezione di microscopia di sferoidi per ottenere il set di dati dei diametri sferoidi RC e RP per eseguire ulteriori calcoli e confronti statistici.
Combina tutti i dati in un unico file di foglio di calcolo. La sonda MMIR1 ha un basso fotosbiancamento ed è adatta per lo studio in tempo reale della risposta respiratoria rapida negli sferoidi hDPSC a diversi stimoli mitocondriali. FCCP ha mostrato solo un lieve effetto di disaccoppiamento in alcune aree e quindi ha leggermente diminuito la respirazione cellulare.
D'altra parte, rotenone ha fortemente inibito la respirazione portando alla riossigenazione sferoide e alla dissipazione dei gradienti di ossigeno dalla periferia al nucleo entro circa 80 secondi dalla stimolazione. Utilizzando il protocollo automatizzato di calcolo del rapporto di intensità pixel per pixel fornito dal software di imaging, i gradienti di ossigeno periferica-nucleo rilevati in tempo reale in tutti i tipi di sferoidi vengono visualizzati con la periferia ossigenata e le nicchie ipossiche al centro. I grafici qui riportati raffigurano i profili di rapporto delle sezioni trasversali sferoidi equatoriali per diversi tipi di sferoidi.
Rispetto agli sferoidi hDPSC omocellulari, gli sferoidi eterocellulari da hDPSC a HUVEC avevano gradienti significativamente più ripidi. Il gradiente di ossigeno periferico-nucleo negli sferoidi eterocellulari è probabilmente generato da hDPSC nella loro composizione secondo l'ossigenazione degli sferoidi hDPSC con forte attività respiratoria. I grafici mostrano che gli sferoidi hDPSC bioprinted avevano una periferia significativamente ossigenata rispetto agli sferoidi misurati prima della bioprinting, mentre la loro ossigenazione del nucleo aveva valori simili.
Se la precipitazione occasionale della sonda disturba la formazione uniforme di sferoidi, filtrare o centrifugare la soluzione della sonda ad alta velocità prima dell'uso. La correzione della misurazione della lunghezza dell'ago e la regolazione della pressione sono passaggi essenziali per abbinare la velocità di bioprinting e il diametro del montante e i microaggregati bioprint in un'impalcatura porosa. Scegli le impostazioni di microscopia per l'imaging della sonda sensibile all'ossigeno, considerando il loro effetto sulla fotostabilità della sonda.
L'imaging dell'ossigeno è compatibile con molti tipi di misurazioni al microscopio vivo. Dopo l'imaging, si può anche eseguire l'immunofluorescenza, estrarre proteine per il Western blotting o eseguire analisi di espressione genica.
