يسمح لنا التصوير داخل الحيوية بمراقبة التفاعلات الفسيولوجية داخل البيئة الدقيقة للورم. وباستخدام هذه الطريقة ، يمكن تقسيم السلوكيات الديناميكية المحددة التي يتم ملاحظتها باستخدام ميزات الأنسجة المحلية. يستخدم هذا البروتوكول فقط إشارة خالية من الملصقات في كل مكان من ألياف الكولاجين أو مستقلبات الفلورسنت الذاتية لتقسيم TME ، وبالتالي تقليل كمية التلاعب بالماوس.
هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على أي نظام داخل الحيوية حيث يلزم فهم التفاعلات الديناميكية المتعلقة بهياكل المصفوفة خارج الخلية أو الهياكل الوعائية. سيوضح هذا الإجراء ديف إنمان ، كبير أخصائيي الأبحاث ، وإيريكا هوفمان ، طالبة الدراسات العليا من المختبر. ابدأ في إعداد زجاج غطاء نافذة تصوير الثدييات عن طريق نقع زجاج غطاء دائري 1.5 12 ملم في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتجفيف زجاج الغطاء تحت مصباح حراري وقم بتأمين الزجاج على إطار نافذة التصوير الثديي المعدني باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate.
علاج المادة اللاصقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم مسحة منقوعة بالأسيتون لتنظيف نافذة التصوير الثديي المجمعة للمادة اللاصقة الزائدة قبل غمر نافذة التصوير الثديي في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق على الأقل للمساعدة في التطهير. بعد التجفيف ، قم بتخزين نافذة التصوير الثديي التي تم تنظيفها في طبق بتري معقم.
قبل البدء في الجراحة لزرع النافذة ، قم بتعقيم الأدوات الجراحية وتعقيم الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإعداد سطح طاولة معقم للجراحة مع بطانية تسخين مغطاة بحقل معقم. اضبط بطانية الاحترار بحيث تكون درجة الحرارة المقاسة أعلى الحقل المعقم 40 درجة مئوية.
استخدم الإضاءة الباردة الإضافية والنظارات المكبرة للإجراء الجراحي. ارتداء معدات الوقاية الشخصية التي تتكون من معطف مختبر معقم يستخدم مرة واحدة ، والأكمام الجراحية ، والقفازات ، وحماية العين ، وقناع الوجه. بعد ذلك ، قم بإزالة فرو الفأر المخدر في الغدة الثديية الإربية الرابعة باستخدام كريم مزيل للشعر وشطف الموقع الجراحي بشاش منقوع بالماء المعقم.
ثم قم بإعداد الموقع الجراحي المزيل للشعر للجراحة عن طريق تعقيم سطح الجلد بثلاثة مقشرات Betadine والإيثانول بالتناوب. عند الانتهاء، ارفعي الجلد بلطف فوق الغدة الثديية رقم أربعة باستخدام الملقط. بمجرد سحب الجلد بعيدا عن جدار الجسم ، قم بإزالة مقطع ملليمتر واحد من الطبقة الجلدية عند طرف الملقط باستخدام مقص مجهري جراحي.
دون قطع الغدة الأساسية ، قم بإنشاء شق 10 ملم ثم حرر الغدة الثديية من الطبقة الجلدية بحركة لطيفة للملقط. أضف PBS لتغطية الغدة المكشوفة. استخدم خياطة مضفرة من الحرير 5-0 لإنشاء خيط خيط محفظة على طول محيط الفتحة ، ثم أدخل حافة نافذة التصوير الثديي بحيث تتفاعل الطبقة الجلدية مع الشق المتلقي لنافذة التصوير الثديي.
أثناء تمديد الظهارة في الطرف الآخر من نافذة التصوير الثديي ، ادفع نافذة التصوير الثديي المعدني إلى مكانها بحيث تقوم الطبقة الجلدية بإشراك الشق المتلقي بالكامل حول محيط نافذة التصوير الثديي بأكمله. ثم قم بربط سلسلة المحفظة لرسم الطبقة الجلدية في الشق وربط الطبقة لتأمين النافذة. ضع مضادا حيويا موضعيا على الطبقة الجلدية في نافذة التصوير الثديي وراقب الماوس باستمرار.
بعد استعادة الوعي الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي ، قم بإيواء نافذة التصوير الثديي المزروعة بالفأر بشكل منفصل على فراش ناعم مع وضع كوخ صغير في القفص والسماح للفأر بالتعافي لمدة 48 ساعة قبل التصوير. للتصوير ، استخدم نظام هواء قسري مضبوط على 30 درجة مئوية. استخدم سخان موضوعي إضافي لتجنب الانجراف في التركيز البؤري Z والسماح للنظام بالوصول إلى التوازن عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التصوير.
ثم قم بإعداد غرفة تدفئة على مسرح المجهر. بعد التأكد من التخدير باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم ، أضف مرهما للعين إلى الماوس. للحفاظ على الترطيب المناسب ، حقن 0.5 ملليلتر من PBS تحت الجلد كل ساعتين طوال مدة جلسة التصوير.
ضع جل مائي بدلا من الماء على الهدف ونظف الجزء الخارجي من زجاج نافذة التصوير الثديي باستخدام قضيب قطني ومنظف زجاج قبل نقل الماوس إلى مرحلة المجهر المسخن مسبقا. بعد وضع الماوس على مرحلة المجهر ، اضغط على طوق نافذة التصوير الثديي في فتحة استقبال 14 ملم في إدراج المرحلة لتحقيق الاستقرار في الصور وتناسب خرطوم الأيزوفلوران. ثم ضع مجال التصوير في بؤرة التركيز باستخدام مناظير المجهر وإضاءة Brightfield ، مع مراقبة الأوعية الدموية مع تدفق الدم.
تحقق من استقرار مجال الرؤية. في حالة وجود قطع أثرية لحركة التنفس ، ضع ضغطا لطيفا على الجانب الخلفي من الغدة باستخدام كتلة رغوة صغيرة وقطعة تشبه السينكريتور من الشريط اللاصق. بعد تطبيق الضغط، تحقق من الحفاظ على تدفق الدم في جميع أنحاء مجال الرؤية.
بمجرد تخدير الماوس ووضعه بشكل آمن على مرحلة المجهر المقلوب ، ابدأ في تحديد المناطق ذات الاهتمام. باستخدام مصدر ضوء موجه إلى نافذة التصوير الثديي ، استخدم مناظير المجهر لتحديد المناطق المحتملة للتحقيق. يجب أن يكون التركيز على رؤية الأوعية الدموية وتدفق الدم.
إضافة وحفظ مواضع XY في البرنامج. عند ضبط مستويات الطاقة المناسبة، قم بإعداد مكدس Z ولاحظ ظهور ألياف الكولاجين الوفيرة على بعد 20 إلى 50 ميكرومتر تحت السطح الزجاجي لنافذة التصوير الثديي. سيصبح الكولاجين أقل انتشارا حيث يقسم المجهر أعمق في الورم.
تكشف الفراغات في الجيل التوافقي الثاني أو SHG عن موقع كتل الورم. ضع شريحة Z العلوية أسفل طبقة الخلايا الانفرادية مع ظهور ألياف الكولاجين الأولى عند 50 إلى 100 ميكرون. ضع شريحة Z السفلية على 250 ميكرومتر حيث تتلاشى الألياف وتهيمن الإشارة الضعيفة.
ثم كرر الإجراء لجميع مواضع XY المحفوظة. بمجرد تعيين نطاق مكدس Z ، قم بزيادة وقت الإقامة إلى ثمانية ميكروثانية وتحسين إعدادات الطاقة والكاشف. قم بتحسين مستويات الطاقة اللازمة لإثارة الأنسجة لكل تجربة واستخدام قوى تصل إلى 90 مللي واط عند 750 نانومتر أو 70 مللي واط عند 890 نانومتر في الفتحة الخلفية للهدف.
بعد ذلك ، ابدأ بفترات زمنية مدتها 10 دقائق بين نقاط التجميع لمعظم أفلام الترحيل داخل المناطق الحيوية واضبط الفواصل الزمنية وفقا للأهداف التجريبية. إذا لوحظت علامات السمية الضوئية مثل تبييض الخلايا أو التألق الذاتي المتزايد بسرعة والتبييض الضوئي المفرط ، فقم بتقليل طاقة الليزر أو زيادة فترات الفاصل الزمني كما تشير الظروف. بالنسبة للتصوير الفلوري مدى الحياة أو FLIM ل NADPH ، ابدأ في معاينة المسح الضوئي وضبط طاقة الليزر حتى تكون قراءة تمييز الكسر الثابت أو CFD بين 10 إلى الخامس و 10 إلى السادس.
تجاوز CFD بعد 10 إلى النتيجة السادسة في تراكم الفوتون والنتائج الإجمالية الضعيفة. بمجرد ضبط مستوى الطاقة ، اضبط وقت التكامل بين 90 إلى 120 ثانية وابدأ مجموعة FLIM للحصول على فوتونات من مجال الرؤية للوقت المخصص. أظهر مجال رؤية نموذجي داخل ورم ثديي خال من الملصقات ألياف كولاجين وفيرة بالقرب من النافذة وانخفاض في الوفرة أعمق في الورم.
ساعد استخدام عمر التألق أو NADPH في تحديد الأوعية الدموية. كانت بعض المناطق المظلمة في الصور عبارة عن طيات الورم أو تعقب فصوص الورم المجاورة. لتحديد الأوعية الدموية ، تم التحقق من صحة صورة مركبة باستخدام NDPH FLIM من خلال مقارنة إسقاطات الكثافة القصوى للمكدس داخل الحيوية قبل وبعد حقن الوريد الذيل من ديكستران الفلورسنت.
ويبين التحليل التمثيلي التحديد الكمي لأربعة فئران ومجالات الرؤية. لتحديد حدود كتل الورم الخالية من الملصقات ، تم استخدام التألق الذاتي NADPH. وذكرت الصور البصمات الأيضية للخلايا وموقع الأوعية الدموية.
كما حدد التألق الذاتي AFD البلاعم. مع مخطط التجزئة ، تم تقسيم الورم الخالي من الملصقات إلى مقصورات لعش الورم والسدى والأوعية الدموية باستخدام SHG و NADPH autofluorescence فقط. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تصنيف ألياف السدى والكولاجين إلى مناطق محلية من الألياف المحاذاة.
أهم شيء يجب تذكره لهذا البروتوكول هو التأكد من أن الماوس مخدوم ومقيد بشكل صحيح بحيث يظل مجال الرؤية مستقرا للتصوير.
